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主题：【转帖】图文解说流式细胞仪及其技术应用

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发表于：2012/05/04 10:47:27 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

4.1 流式细胞仪基本原理

1. 生物学颗粒分析原理

① 流式细胞技术是在单细胞水平上，对于处在快速直线流动状态中的大量细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术，现已成为现代医学研究最先进的分析技术之一。应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的技术称为流式细胞术。

② 生物学颗粒包括大的免疫复合物、DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细菌、霉菌、染色体、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等，所检测的生物颗粒的理化性质包括细胞大小、细胞形态、胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白质含量、细胞膜完整性和酶活性等。

③ 流式细胞仪是以激光为光源，集流体力学技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。

④ 流式细胞仪是在荧光显微镜技术、血细胞计数仪和喷墨技术的基础上发展起来的。

⑤ 鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，与水平方向的激光束垂直相交，染色的细胞受激光照射后发出荧光，这些信号分别被光电倍增管荧光检测器和光电二极管散射光检测器接收，经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得到细胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性质等物理和生化指标。

2. 流式细胞仪细胞分选原理
在压电晶体上加上频率为30kHz的信号，使液柱断裂成一连串均匀的液滴。当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内，从而达到细胞分类收集的目的。

4.2 流式细胞仪的分类和基本结构
1. 流式细胞仪的分类
流式细胞仪根据功能不同可分为临床型(亦称台式机)和科研型（亦称大型机）。
流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。

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2012/5/4 10:48:10 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

2. 流式细胞仪的基本结构

流式细胞仪的结构可分为流动室及液流驱动系统；激光光源及光束成形系统；光学系统；信号检测与存贮、显示、
分析系统；细胞分选系统等五个部分。

（1）流式细胞仪流动室与液流驱动系统
流动室是FCM的核心部件，被测样品在此与激光束相交。流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。

（2）流式细胞仪激光光源与光束成形系统
激光是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。激光光束在到达流动室前，先经过透镜将其聚焦，形成几何尺寸约为22μm
×66μm即短轴稍大于细胞直径的光斑。

（3）流式细胞仪光学系统
FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入不同的电子探测器。
作为FCM光学系统中的主要光学元件的滤光片，主要分为长通滤片、短通滤片和带通滤片三类。
①长通滤光片
②短通滤光片
③带通滤光片

（4）流式细胞仪信号检测与分析
① 散射光信号散射光分为前向角散射和侧向角散射，散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)，称为细胞的物理参数
Ⅰ 前向角散射前向角散射与被测细胞的大小有关，确切地说与细胞直径的平方密切相关。
Ⅱ 侧向角散射侧向角散射是指与激光束正交900方向的散射光信号。侧向散射光对细胞膜、细胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供细胞内精细结构和颗粒性质的信息。
②荧光信号当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析能了解所研究细胞的存在和定量。
Ⅰ 荧光信号线性测量和对数测量：
Ⅱ 荧光信号的面积和宽度
Ⅲ 光谱重叠的校正
从下图可以看出，阴影为探测器检测光谱的范围，FITC探测器会探测到少量的PE光谱，而PE探测器则检测到较多的FITC光谱。克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路，利用已知标准样品或荧光小珠，可合理设置荧光信号的补偿值。

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2012/5/4 10:48:48 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

下图中点A通过透镜f成像在A’处，而点B通过透镜f成像在B’处。在光电倍增管前放上一小孔，作为空间滤波器，排除其它杂散光信号，从而确保了A点光源进不了B’点处，B点光源也进不了A’点处。因此，避免第一激光(488nm)激发出的FL1，FL2，FL3和第二激光(635nm) 激发出的FL4间的补偿。当然FL1，FL2和FL3是来自于同一点光源，它们之间的补偿是不可避免的。

（5）流式细胞仪细胞分选器
细胞分选器由水滴形成、分选逻辑电路、水滴充电及偏转三部分组成。
① 小水滴的形成安装在流动室上的压电晶体加有数万赫兹的电信号，于是压电晶体带动流动室一起振动。液流从喷孔出
来后，需要经过一段距离才被破坏形成水滴。
② 逻辑电路给水滴充电的脉冲并不是在做出分选决定时立即产生并加到流束上的，而是当细胞达到分离点时才加上的。
③ 水滴的充电与偏转当水滴从流束上将要断开时给整个流束充电，则水滴从流束上断开后便带有同极性的多余表面电荷。
（6）流式细胞仪测量数据的存贮、显示与分析
目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光标记物参数数量在逐渐增多。
4.3 流式细胞仪的主要性能指标
1. 荧光测量灵敏度
灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标。一般以能检测到单个微球上最少标有FITC或PE荧光分子数目来表示，现在的FCM均可达到检测小于100个荧光分子的指标。
2. 仪器的分辨率
分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数CV(Coefficient of Variation)值表示。
3. 前向角散射光检测灵敏度
前向角散射光检测灵敏度是指能够检测到的最小颗粒大小，一般目前商品化的FCM可以测量到0.2μm～0.5μm左右。
4. 分析速度
一般可达到3000个/秒～6000个/秒左右，大型机已达到每秒几万个细胞。
5. 分选指标
分选指标主要包括分选速度、分选纯度和分选收获率。
4.4 流式细胞仪应用的技术要求
1. 检测样品制备的重要性
如果两个或多个细胞间粘连重叠或细胞碎片过多，都会影响信号的收集及所收集信号的真实性，所以制备单细胞悬液是
进行流式细胞仪分析最关键的第一步。
2. 免疫分析中常用的荧光染料与标记染色
荧光信号来自于细胞的自发荧光或被分析细胞经特异性荧光标记染色后通过激光束激发后所产生的。因此，被分析细胞在制备成单细胞悬液后，经过与荧光染料染色后才能上机进行检测。
3. 流式细胞仪操作技术的质量控制
① 光路与流路校正 CV值越小，则仪器工作状态精度越高。CV值一般在2％～3％左右，不超过5％～10％。
② PMT校准对光电倍增管的校正是流式细胞仪在使用前进行的一项重要质控指标。
③ 绝对计数的校准在进行免疫学检测时，常需对测定细胞进行绝对计数。

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2012/5/4 10:51:04 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

4.5 流式细胞仪的维护及常见故障的排除
1. 仪器的维护
2. 常见故障及排除

4.6 流式细胞仪的临床应用
1. 流式细胞仪在免疫学中的应用
2. 流式细胞仪在血液学中的应用
3.流式细胞仪在细胞生物学中的应用
4. 流式细胞仪在肿瘤学中的应用
5. 流式细胞仪在AIDS病检测中的分析
6. 流式细胞仪对自身免疫性疾病相关HLA抗原的分析
7. 流式细胞仪在药物学方面的应用

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