摘要：可拉酸是一种胞外多糖，在肠杆菌中存在，并具有促进健康和延长秀丽隐杆线虫寿命的作用。可拉酸在真核生物细胞的线粒体调控中也发挥着重要作用。该研究提出了一种使用蔗糖诱导细菌固态发酵生产和纯化可拉酸的方法，并通过实验验证了其可行性。研究结果表明，蔗糖诱导显著提高了可拉酸合成基因的转录水平，从而显著增加了可拉酸的产量。所获得的固态可拉酸产品纯度达到99.2%，超过了传统的液态发酵方法。该创新方法在产量方面以12.6 g/L培养基的可拉酸得率表现出了传统方法无法比拟的优势。研究结果有助于探索可拉酸在细菌存活和生长以及真核细胞线粒体调控中的多种应用。此外，蔗糖诱导发酵方法在可拉酸的大规模生产方面具有潜力，为其在食品、药品和生物技术等各个行业的商业化铺平了道路。

关键词：可拉酸；发酵；蔗糖；阪崎肠杆菌；纯化

中图分类号：Q93 文献标识码：B

Sucrose-Induced Bacterial Solid-State Fermentation Production and Purification of Colonic Acid

Ji Xuemeng

（School of Medicine, Nankai University, Tianjin 300071, China）

Abstract: Colanic acid is an extracellular polysaccharide found in Enterobacteriaceae, which plays a role in promoting health and extending the lifespan of Caenorhabditis elegans. It also serves an important role in mitochondrial regulation in eukaryotic cells. This study proposes a method for sucrose-induced bacterial solid-state fermentation to produce and purify colanic acid, and its feasibility has been experimentally validated. The research results demonstrate that sucrose induction significantly increases the transcription levels of colanic acid synthesis genes, resulting in a remarkable enhancement in Colanic acid yield. The obtained solid-state colanic acid product exhibits a purity of 99.2%, surpassing the conventional liquid fermentation approach. This innovative method achieves a colanic acid yield of 12.6 g/L medium, outperforming traditional methods in terms of productivity. The findings of this study contribute to exploring the diverse applications of colanic acid in bacterial survival, growth, and mitochondrial regulation in eukaryotic cells. Furthermore, the sucrose-induced fermentation approach holds promise for large-scale colanic acid production, paving the way for its commercialization in various industries such as food, pharmaceuticals, and biotechnology.

Key words: colonic acid; fermentation; sucrose; Cronobacter sakazakii; purfication

微生物胞外多糖是细菌、真菌、蓝藻等微生物在代谢过程中产生的对微生物有保护作用的生物高聚物^[¹^]。在自然条件下，多数细菌被多糖包被。包被于细菌表面的多糖对于细菌在竞争环境中的存活和生长都有重要作用。细菌多糖的存在一方面可以提高细菌对抗菌物质的耐受能力，如表面活性剂^[²^]、抗生素^[³^]和吞噬细胞^[⁴^]等，另一方面，多糖可以提高细菌对不良环境的适应能力^[5]，如防止细胞失水、防止细胞冻伤等。另外，微生物多糖具有独特的物理和流变特性，在食品工业中被广泛用作稳定剂、增稠剂、凝胶剂和乳化剂^[^6-9^]。近年来研究发现细菌多糖在抗肿瘤、抗病毒、免疫刺激、抗炎症活性和抗氧化作用、调节产羔菌群等方面表现出了显著的生物活性^[¹⁰^]，因此引起了人们的更多关注。

可拉酸[Colanic acid]是胞外多糖的一种，主要发现存在于肠杆菌中。可拉酸是一种白色纤维状的无定型结构杂多糖，主要由D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖和 L-岩藻糖组成，还包含 O-乙酰和丙酮酸等多种侧链上的化学修饰结构，是一种高分子量的杂多糖^[¹¹^]。可拉酸包裹在细胞表面，能使菌株表现出黏液化现象^[¹²^]。2017年在细胞杂志上首次报道了可拉酸使得线粒体片段化且具有延长秀丽隐杆线虫寿命的作用^[¹³^]。目前主流观点认为真核生物的线粒体来源于变形菌门细菌，而多数变形菌门细菌含有可拉酸合成基因，因此，可拉酸对于真核生物细胞的线粒体具有调控作用是不难理解的。变形菌门细菌在人体肠道中大量存在^[¹⁴^]，因此，可以推断可拉酸也是肠道中天然存在的细菌分泌物。

衰老与长寿是人类永久的研究课题，在秀丽线虫上已经证实可拉酸对健康有促进作用，可拉酸的功能与作用机制或许成为未来的研究热点。但是，目前仍然没有商品化的可拉酸提取物，也缺少完善的可拉酸生产与纯化方法，这严重限制了可拉酸的研究。因此亟需可拉酸发酵与纯化方法的研究。目前已报道的利用大肠杆菌生产可拉酸的产量很低，在已有的文献报道中，最高产量在1.0 g/L^[15]。提高微生物发酵生产可拉酸的产量是很重要的科学研究。液态发酵为减少后续纯化成本，往往采用基础培养基发酵，导致细菌的生长状态不理想，在已有的文献报道中，可拉酸浓度最高时菌株的OD₆₀₀仅为5.0左右。而采用LB等培养基发酵生产可拉酸，虽然可以获得较高细菌密度，但是也会引入较多杂质，增加了产物纯化难度。

有鉴于此，本实验旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种蔗糖诱导细菌固态发酵生产可拉酸及纯化方法。

1 实验方法

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图1 可拉酸发酵与纯化的技术路线图

1.%2 蔗糖固体培养基的配制

制备含有1.5%（w/v）琼脂粉、20%（w/v）蔗糖的LB培养基200mL，115℃高压蒸汽灭菌15分钟，灭菌后待培养基降温至60℃倒平板。平板内培养基凝固后放入4℃冰箱待用。

2.%2 细菌的活化与接种

阪崎肠杆菌ATCC BAA-894从美国菌种保藏中心ATCC购得并甘油保藏于天津市食品科学与健康重点实验室。阪崎肠杆菌ATCC BAA-894在液体LB培养基中37℃，200rpm震荡培养过夜，然后离心沉淀并用PBS反复清洗3次菌体，最后用PBS重新垂悬菌体。每个12mm直径LB固体平板接种50μL菌悬液并用涂布棒涂匀，一共接种10个平板。将接种细菌后的LB平板置于37℃恒温培养箱培养24-48小时，平板正放培养。否则黏液状的细菌会流出平板。

3.%2 可拉酸受蔗糖诱导表达

可拉酸的提取纯化工艺如图1所示。使用L型涂布棒刮取固体培养基表面生长的细菌以及附着的黏液，溶于水中，使用移液器反复吹打菌体使得菌体被打散，然后将菌液煮沸5分钟；5,000g 离心2分钟使得菌体沉淀，弃去沉淀，保留上清；上清中加入冰醋酸，使得冰醋酸终浓度为 0.1%(v/v)，并且冷却至4℃；30,000g离心力4℃离心30分钟使得脂多糖沉淀，弃去沉淀，保留上清；利用旋转蒸发仪器减少水分，再利用真空干燥得到可拉酸粗品；固体干燥物复溶于水，使用15KD超滤管3,500g离心20分钟进一步纯化样品；纯化后的可拉酸样品再次真空干燥得到固态样品，称重为2540mg。

2 结果与分析

2.1 可拉酸受蔗糖诱导表达

将接种细菌后的LB平板置于37℃恒温培养箱培养24-48小时，平板正放培养，否则黏液状的细菌会流出平板。rt-qPCR检测蔗糖对可拉酸合成基因wcaB（ESA_01160）转录水平的影响，提取RNA，反转录后，使用引物Fwd：5'-TATCGCATCGCGCACTTCTG-3'和Rev：5'-GGCGGCCTGAATTTCATACC-3' 扩增wcaB，提取使用引物Fwd：5'- GAGTGGCGGACGGGTGAGT-3'和Rev：5'- GTCCGTAGACGTTATGCGGTATTAG-3' 扩增16s rDNA作为参照，可见蔗糖诱导可拉酸合成基因wcaB的转录水平提高50% （图2）。24-48小时后平板上可见大量黏液状的细菌分泌物（图3），图3中左为LB培养基，右加20%蔗糖的LB培养基。

图2蔗糖诱导可拉酸合成基因wcaB转录激活

图3蔗糖诱导细菌大量产生可拉酸（左：无蔗糖，右：加蔗糖）

2.2 可拉酸的纯度

最终得到的固态样品（如图4所示）制成10.00 g/L的水溶液。测定其中可拉酸浓度的方法为：首先配制岩藻糖母液10g/L，将母液稀释成1至10g/L的浓度梯度。取4.5ml硫酸水溶液(6：1v/v)中加入50μL的标品溶液，100℃煮沸20min。冷却至室温，分别测定A1和A2的吸光值(随后加入100ul的1M的半胱氨酸盐，再次测定A1’和A2’的吸光值。计算ΔA=ΔA1-ΔA2(ΔA1＝A1’–A1，ΔA2＝A2’- A2)。以岩藻糖浓度为横坐标，以ΔA为纵坐标，绘制标准曲线。得到y＝0 .0597x+0 .0234(R2＝0 .9975)。根据岩藻糖标准曲线得到生产的可拉酸中含有的岩藻糖的浓度，并通过可拉酸中岩藻糖所在百分含量(36 .61％)得到溶液中可拉酸的含量为9.92g/L。因此最终得到的固体可拉酸纯度为9.92/10.00 = 99.2%。

图4纯化后的可拉酸冻干产品

2.3 可拉酸的得率

真空干燥得到固态样品为2540mg，纯度为99.2%。本实施例共使用固体培养基200mL，2540×99.2%/200=12.60(g/L)。因此可拉酸得率达到12.6g/L培养基，高于目前现有技术的大肠杆菌液态发酵10.22g/L可拉酸产率。

3 结论

在细菌中，可拉酸的合成受到Rcs磷酸化信号系统正向调控，而Rcs系统可被蔗糖引起的高渗透压激活。因此，加入蔗糖可激活Rcs系统，进而引起可拉酸的高表达，提高可拉酸的产量；而可拉酸作为一种细菌可利用的碳源，又可以促进细菌的生长，缩短发酵时间；另外，蔗糖作为一种小分子，在后续的超滤中可以被很容易的去除，因此，也不会增加纯化难度。

4 结语

这项研究不仅为可拉酸的生产开辟了新的途径，还为了解可拉酸的功能和机制奠定了基础。研究结果有助于探索可拉酸在细菌存活和生长以及真核细胞线粒体调控中的多种应用。此外，蔗糖诱导发酵方法在可拉酸的大规模生产方面具有潜力，为其在食品、药品和生物技术等各个行业的商业化铺平了道路。总的来说，本研究为了解可拉酸的潜力提供了宝贵的见解，并为进一步的研究和创新开辟了可能性。

参考文献(References)：

［1］张钊瑞,张晨,李大鹏.微生物多糖的结构与应用研究进展[J].食品研究与开发,2021,42(01):182-192.

［2］李伏益, 史立文, 钟凯, 等. 生物基表面活性剂的研究进展[J]. Detergent & Cosmetics, 2022, 45(10).

［3］杨艳北, 许晶, 沈城辉, 等. 低浓度红霉素对猪链球菌蛋白表达, 交叉耐药性与荚膜多糖的影响[J]. 微生物学报, 2022, 62(5): 1843-1850.

［4］谢黎卿, 杨洋, 彭远义, 等. 病原微生物荚膜多糖的生物学功能[J]. 畜牧兽医学报, 2021, 52(3): 576-587.

［5］赵佳伟, 敖晓琳, 蔡义民, 等. 金属离子对植物乳杆菌 RS66CD 生物膜形成及环境耐受性的影响[J]. 食品与发酵工业, 2019, 45(21): 46-52.

［6］柳芳伟, 殷军艺, 聂少平. 基于多糖基增稠剂产品开发现状与发展趋势[J]. 中国食品添加剂, 2023, 34(1): 37-45.

［7］黄小倩,李佳琪,孙家会, 等. 多糖的修饰及其改善乳化性能的研究进展[J].食品工业科技,2023,44(09):437-445.

［8］张欣,解双瑜,孙波.多糖稳定剂在大豆冰淇淋中的应用[J].食品研究与开发,2022,43(05):142-149.

［9］王善勇,祁海松,项舟洋.两亲性海藻多糖在乳化和分散中应用的研究进展[J].生物质化学工程,2022,56(01):37-46.

［10］刘荣瑜,王昊,张子依, 等. 多糖与肠道菌群相互作用的研究进展[J].食品科学,2022,43(05):363-373.

［11］汪宸卉. 大肠杆菌脂多糖对可拉酸合成的调控机制研究[D].江南大学,2020.DOI:10.27169/d.cnki.gwqgu.2020.000479.

［12］ Chen J, Lee S M, Mao Y. Protective effect of exopolysaccharide colanic acid of Escherichia coli O157: H7 to osmotic and oxidative stress[J]. International journal of food microbiology, 2004, 93(3): 281-286.

［13］ Gruber J, Kennedy B K. Microbiome and longevity: gut microbes send signals to host mitochondria[J]. Cell, 2017, 169(7): 1168-1169.

［14］郭仕辉, 余永涛, 万佳宏, 等. 变形菌门与哺乳动物结肠肠道菌群失调相关研究进展[J]. 中国微生态学杂志, 2022, 34(4): 479-484.