主题：【分享】2方法 制备感受态细胞

（二）用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞
　　下面的简单方案是Clhen等（1972）所用方法的变通方案，常用于成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克螺旋质粒ＤＮＡ产生5x106-2x107个转化菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株，并且比方案Ｉ快速，重复性更好。该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。
１）从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落（直径２－３mm），转到一个含有100ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约３小时（旋转摇床，300转/分）。为得到有效转化，活细胞数不应超过108细胞ml，可每隔20-30分种测量OD600值来监测培养物的生长情况。在菌株与菌株之间，ＯＤ600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的ＯＤ600值，并将各黧度的增减物铺于无抗生素的ＬＢ琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。
２）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管（Falcon 2070）中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至０℃。切记：下述所有步骤均需无菌操作。
３）于４℃用Sorvall GS3转头（或与其相当的转头）以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。
４）倒出培养液，将管倒置１分钏以使最后残留的痕量培养液流尽。
５）以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。我们发现将１mol/L CaCl2贮存液[用纯水（Ｍille-Q级或与其相当的级别）配制]以10ml小份贮存于-20℃煞是方便。制备感受态细胞时，取一小份融化，用纯水稀释至100mlk，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷到０℃即可。 对于大多数大肠肝菌菌株（除ＭＣ1061外），在这一步采用TFB（见表1.3）代替氯化钙可得到相同的或更好的结果。
６）于４℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。
７）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。
８）每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2[或ＴＦＢ，见表1.3和步骤５）注]重悬每份细胞沉淀。此时，可将细胞分成小份，放于-70℃冻存.在这些条件下，尽管长期保存后转化效率会稍有下降，但细胞仍可保持处于感受态。Dagert和Ehrlich(1979)曾表明细胞可以于４℃在CaCl2溶液中保存24-48小时，在贮存的最初12-24小时内，转化效率增加３－５倍，然后降低到初始水平。
９）用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加ＤＮＡ（体积∞10μl''ＤＮＡ∞50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。
10）将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管回上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。
11）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却１－２分钟。
12）每管加800μlＳＯＣ培养基（见附录Ａ）。用水溶将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。如果要求更高的转化效率，在复苏期中，应温和地摇动细胞（转速不超过225转/分）。
13）将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和相应抗生素的ＳＯＢ琼脂培养基上。如培养物体积太小（〈10μl）。可再加肉汤培养基，用一无菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂平板表面。 如在一个90mm平板上铺200μl以上的感受态细胞，应离心浓缩细胞，然后用适量ＳＯＣ轻轻重悬细胞。如用四环素抗性作为选择标记，全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上（或铺在软琼脂中）。然而如选用氨苄青霉素抗性，则只能将一部分培养物（根据实验决定）铺在单独的平皿上。氨苄青霉素抗性功的增加与平皿上所加细菌数的增加并无线性比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞可释放生长掏物质的缘故。
14）将平板置于室温直至液体被吸收。
15）倒置平皿，于37℃培养，12-16小时后可出现菌落。如检查氨苄青霉素抗性，用转化细胞铺增板时密度较低（每个90mm平板不超过104菌落），于37℃培养平板时不应超过20小时。氨苄青霉素抗性的转化可将β－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生素。这样，铺平板时密度太高或培养时间太长都会导致出现对氨苄青霉素敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄青霉素而改用羧苄青霉素，以及将抗生素浓度从60μg/ml增至100μg/ml，可使情况有所改善，但不能彻底根除之。可以采用几种策略来进行外源ＤＮＡ片段和质粒载体的连接。对此，可依据外源ＤＮＡ片段未的性质，以及质粒载体与外源ＤＮＡ上限制酸切位点的性质来作出选择。

（一）外源ＤＮＡ片段未的性质


带有各种未的外源ＤＮＡ的克隆方法见下表：

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外源ＤＮＡ片段所带未端 　　克隆的要求 　说明

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平端 　　　要求高浓度的ＤＮＡ和连接酶

1)非重组体克隆的背景可能较高　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

2)质粒和外源DNA拼命处的限制酶切位点消失　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

3)重组质粒会带人外源DNA的串联拷贝

用两种限制酶消化后　 需纯化 　

1)质粒与外源DNA拼命处的限制酶切位点常可保留不同的突出端
2)非重组体克隆的背景较低质粒体以尽量提高连接效率
3)外源DNA只以一个方向插入到重组质粒中

相同的突出端 线状质粒DNA常用磷酸酶处理

1)质粒与外源DNA接合处的限制酶切位点常可保留
2)外源DNA会以两个方向插入
3)重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝

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１．带有非互补突出端的片段
　　用两种不同的限制酶进行消化可以产生带有非互补突出端的片段，刀就是最容蜴 克隆的片段。常用的大多数质粒载体均带有由几个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点。由于现有的多克隆位点如此多样，因而几乎总是能找到一种带有与外ＤＮＡ片段未匹配的限制切位点的载体。于是，采用所谓的定向克隆即可将外源ＤＮＡ片段插入到载体当中。例如：载体pUC19用BamHl和Hind－Ⅲ进行消化，然后，通过凝胶电泳或大小排阻凝胶层析纯化载体大片段，以使同芤下来的多克隆位点 缺小片段分开。于是，这一载体就可以同有与BamHl和ＨindⅢ所切出未端相匹配的粘端的外源ＤＮＡ区段相连接。用得到的环状重级体化大肠杆菌，检查氨苄青霉素抗性。由于HindⅢ和BomHI的突出端不互补，载体片段不能有效地环化，所以转化大肠杆菌的效率也极低。因此，大多数具有氨苄表霉素抗性的细菌都含有带外源ＤＮＡ区段的质业，外源ＤＮＡ区段成为连接HindⅢ和BamHI位点的桥梁。当然，可以根据特定的外源ＤＮＡ区段来改变限制酶的组合方式。
　　如要制备定向克隆载体，它尽量避免使用大多克隆位点上彼此直接相邻的限制酶切位点。这些位点中的一个被切开以后，第二个位点应位于线状ＤＮＡ分子一端的几个碱基对之内，这样过于靠近末端，不利于多种限制酶的有效切割。正因为如此，所以务必检查两种限制酶对载体的消化是否完全。可采用以下两种检查方法： １）用两种限制酶中的一种对载体进行消化，当所用限制酶的最挞缓冲液对离子强度的要求有不同时，应使用所要求的盐浓度较低的酶。消化完后，应通过凝胶电泳对一小份ＤＮＡ进行检查。如所有质粒ＤＮＡ均从环状转变为线状分子时，适当调整盐浓度，并加入第二种酶。同时，另行设立一个预实验，其中含有环状质粒ＤＮＡ，并只加两种限制酶中的第二种。当预实验中的所有ＤＮＡ都转变为线状（由凝胶电泳确定）时，通过凝胶电泳或尺坟排阻凝胶层析纯化质粒ＤＮＡ大片段。\par ２）图1.7所示的是检查消化反应完全程度的一种更为严格的方法。对用第一个限制酶切割的一小份ＤＮＡ进行末端标记，经离尽柱层析法纯化后，与未标记的线状ＤＮＡ混合。然后用第二个酶消化，完全消化可使ＤＮＡ小片段释放，它应带有50％的放射性活度，这可通过层析或通过凝胶电泳和放射自显影加以检测。

２。带有相同末端（平端或粘端）的片段
　　带有相同末端（平端或粘端）的外源ＤＮＡ片段必须克隆到具有匹配末端的线状质粒载体中。在连接反应中，外源ＤＮＡ和质粒都可能发生环化，也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个ＤＮＡ的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平（见本节三）．此外，常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制质粒ＤＮＡ的自身连接和环化。在体外连接反应中，仅当一个核苷酸含5’磷酸基团而另一个含3’羟基时，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶可催化相邻核苷间形成磷酸二酯健。用细菌碱性磷酸酶(BAP)或牛小肠碱性磷酸酶(CIP)去除线状ＤＮＡ两端的5’磷酸可以最大限度的地减少质粒ＤＮＡ区段可有效地与去磷酸化质粒ＤＮＡ相连接，产生一个含有两个切口的开环分子（图1.8）。因为环状ＤＮＡ（即使是带切口的环状ＤＮＡ）的转化效率比线状ＤＮＡ高得多，所以大多数转化体都含有重组质粒。

３．带有平端的片段
　　外源ＤＮＡ片段带平端时，还有一桩切外生枝的麻烦事，这就是蛱端的连接效率比起带有突出互袜末端的ＤＮＡ要低得多。因此，涉及平端分子的连接反应所要求的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶的浓度和外源及质粒ＤＮＡ的浓度都要高得多。还要说明的是，加入低浓度的如聚乙二醇一类的物质，常可提高这类反应的效率。

（二） 质粒载体和外源ＤＮＡ中限制酶切位点的性质
　　如今，质粒载体中限制酶切位点的种类极为繁多，因而通常都有可能找到某种带限制酶切位点恰恰与外源ＤＮＡ片段本身毫无二致的载体。这就具备一个不可比拟的优点，也应是可以用相应的限制酶消化重组质粒崦回收外源ＤＮＡ。另一种方案，则是把片段插入到载体中能产生匹配末端的任何位点中。例如，识别不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ产生具有相同突出末端的限制酶切片段，这样用BglⅡ消化而制备的外源ＤＮＡ片段可以克隆到用BanHl消化的质粒中。这通常会使接合序列不能被曾用于外源ＤＮＡ或制备载体的任何一种酶所切开。然而很多清况下，用切点位于多克隆序列侧翼的限制酶进行消化，可将片段从重组质粒中摘出。偶尔在质粒的以及外源ＤＮＡ两端的限制酶切位点之间，不可能找到“门当户对”的搭配关系。这时可用下面两种方案加以解决：
１）在线状质粒末端和（或）外源ＤＮＡ片段的末端接上合成在接头或衔接头。
２）在得到控制的反应条件下，用大肠杆菌ＤＮＡ聚合酶I Ｋlenow片段部分补平带3’凹端的ＤＮＡ片段。如第九章所讨论，这样常可以使那些不相匹配的限制酶切位点转变为互补末端，从而促进载体和外源ＤＮＡ的连接。因为部分补平反应消除了同一分子两端彼此配对的能力，故连接反应过程中环化和自身寡聚化的机会也会有所降低（Hung和Wensink''1984;Zabarovsky和Allikmets''1986）。

细胞成长还要做哪些呢