主题：【分享】51.10 创新药物丹参素钠的体内分析及其代谢研究

【作者】魏华 
【摘要】：药物代谢动力学旨在通过测定生物样本中的药物或者代谢产物的浓度,定量描述药物进入体内以后的吸收、分布、代谢、排泄过程,进而阐明药物的药效或者毒性,为新药研究的代谢筛选和临床用药的疗效评价提供重要依据。丹参素为从唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根中提取出的单体化合物,具有明显的药理活性。作为丹参的主要活性成分之一,有必要对丹参素进行药代动力学研究,探讨其体内过程。本文建立的LC-MS/MS法测定血浆、尿液、胆汁等多种生物样本中的丹参素钠浓度,满足临床前药代动力学研究对高灵敏度、高选择性检测的技术要求。此外,本文还进行了丹参素钠的体内、体外代谢研究,初步建立了体外代谢筛选研究平台,为进一步开展临床用药及剂型开发提供参考依据。 一、生物样品中丹参素钠定量分析方法的建立与确证 在临床前药代动力学研究中,定量分析方法的建立与确证占有举足轻重的地位,只有建立可靠、专一、灵敏、快速的生物样品分析方法,才能保证药代动力学研究的顺利进行。本文采用高灵敏度的LC-MS/MS方法检测生物样品中丹参素钠的浓度,生物样品以盐酸酸化后用乙酸乙酯提取其中的丹参素钠。色谱分析采用迪马Diamonsil C-18,5μm,200×4.6mm,柱温25℃;流动相组成为甲醇:水=80:20(含0.01‰甲酸),采用等梯度洗脱方式,流速0.80mL/min,3:2分流入质谱的流速为0.32mL/min,进样量20μl。质谱检测采用ESI离子源、负离子检测模式,选择MRM工作方式进行质谱分析。经完整的方法学确证,所有测定生物样品的线性、准确度、精密度、回收率、基质效应、稀释效应、稳定性等均满足生物样品的定量分析要求。该方法成功用于SD大鼠的药代动力学研究及尿液和胆汁的排泄研究。 二、丹参素钠在SD大鼠体内的临床前药代动力学研究 本试验设计SD大鼠单剂量尾静脉注射给药丹参素钠15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg三个剂量组进行药代动力学研究。采用LC-MS/MS测定方法分别测定了给药后不同时间的体内丹参素钠血药浓度。按血浆样品预处理操作,测得数据代入相应样品随行标准曲线中求得含量。经非房室模型法估算药代动力学参数。结果表明,大鼠单剂量静注给药丹参素钠15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg三个剂量组药代动力学药时曲线末端相消除半衰期(t1/2)分别为2.73h、2.37h、1.95h;AUC0～∞分别为15.29μg·h/mL、34.58μg·h/mL和58.49μg·h/mL,AUC与给药剂量基本呈正相关,相关系数r~2为0.9836。 SD大鼠单剂量尾静脉注射给药丹参素钠30mg/kg后,于给药后收集0～96h的尿液,按尿液样品预处理操作,测得数据代入相应样品随行标准曲线中求得含量。结果表明,丹参素钠在SD大鼠体内主要经尿液排泄,96h药物累积排泄量为46.99%。SD大鼠单剂量尾静脉注射给药丹参素钠30mg/kg后,于给药后0～24h取其胆汁,按胆汁样品预处理操作,测得数据代入胆汁样品随行标准曲线中求得含量。结果表明,丹参素钠在SD大鼠体内经胆汁排泄量少,24h内胆汁累积排泄量为给药剂量的0.82%。综上所述,丹参素钠在SD大鼠体内主要以原型药的形式直接由尿排出体外。 三、丹参素钠体内外代谢的初步研究 丹参素钠给药后大鼠胆汁和尿液样品的分析结果显示,其进入体内后,主要发生II相代谢反应,主要代谢物为:甲基化丹参素[M-H+14]~-、硫酸酯结合物[M-H+80]~-、甲基化硫酸酯结合物[M-H+94]-、经尿液排出体外;胆汁中主要存在着甲基化丹参素。丹参素钠经在体肠灌流、原位肝灌流等实验后,主要产生甲基化代谢产物,说明这些器官组织中存在着参与其甲基化反应的酶。经过体外肝匀浆、肝微粒体、肾匀浆、肾微粒体温孵后,主要代谢产物为甲基化丹参素。丹参素钠在大鼠肝微粒体酶中代谢的酶动力学结果显示,它在大鼠肝微粒体酶中代谢的Vmax为185.19ng/(mL·min·mg)蛋白,Km为98940.74ng/mL,即5.0×10~(-4)mol/L,内在代谢清除率Clint为1.87×10~(-3)mL/(min·mg)蛋白。此外,本章还进行了丹参素钠在COMT单一酶中的酶促反应动力学研究。与肝微粒体酶相比,丹参素钠与COMT有较大的亲和力,Vm、Km与Clint均偏大:Vmax为243.90ng/(mL·min·mg)蛋白,Km为102156.1ng/mL,即5.16×10~(-4)mol/L,内在代谢清除率Clint为2.34×10~(-3)mL/(min·mg)蛋白。说明催化丹参素发生甲基化反应的主要酶是COMT。
【关键词】：丹参素 LC-MS/MS 药代动力学 排泄 大鼠 代谢产物 肝微粒体 酶促反应动力学 COMT
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R96