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主题：【第六届原创】翻译过来的土壤肥料分析方法-纸层析法分析聚磷酸混合物

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绿洲

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发表于：2012/09/08 08:57:48 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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2012/9/8 8:58:36 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

以下是我翻译的。

纸层析法分析不同组成的磷酸混合物

在Ebel的纸层析技术基础上开发了几种分析聚磷酸混合物组成的方法。开发了一种定量分析正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸、环状聚磷酸以及长链聚磷酸的方法。在一维层析的基础上，本技术使用了二维层析色谱法，第二种流动相的流动方向与第一种相反（呈180度角）。这个方法和Ebel的技术（两种流动相呈90度角），在实验中可以交替使用。层析分离后使用比色法分析，这使得快速定量成为可能。用此方法对三聚磷酸钠进行了分析。层析过程中发现有一定的水解，对此进行小幅度的校正有助于得到更精确的结果。

虽然最近对磷酸盐混合物的分析已经取得了较好的结果，我们还是需要一个较快的、使用常用的仪器和试剂能够对聚磷酸盐混合物以及含聚磷酸盐的物质进行定量的方法。有两个科研小组用纸层析法对无机磷化合物的分析研究的比较透彻，一个在加拿大，另一个在法国。加拿大的研究者开发的定量分析法使用的色谱分离时间比本文所述的方法要长。法国的研究者通过提高溶剂前沿来提高各组分的分离程度。他们已经开发了二维分析法来分离直链和环状聚磷酸。

Ebel描述的半定量法已经被改进成为一个相当精确的定量方法，这是用“样品带”代替“样品点”，并缩短实验时间来减少水解达到的。化验过程所需的时间比以前的研究需要的时间要短。

实验部分

仪器和耗材

矩形缸，规格为12*8*6英寸；

圆柱形缸，底部6英寸直径，开口处3.5英寸直径，11英寸高，配盖子；

微量移液器，50微升，分度为10微升；

铂金丝，直径0.02英寸；

喷瓶；

紫外灯，长波，覆盖面积为9*9英寸；

水浴锅，可放置若干个600毫升烧杯；

光度计；

纸层析专用纸。

试剂：

Ebel层析液：

酸性层析液：将50g三氯乙酸溶于250毫升水，与750毫升异丙醇、2.5毫升浓氨水混合。

碱性层析液：将400毫升异丙醇、200毫升异丁醇、390毫升水、10毫升浓氨水混合均匀。

纸层析显色液：溶解1g四水合七钼酸铵于100毫升水中，与5毫升高氯酸、1毫升浓盐酸混合均匀。

浓缩剂和水解剂：氨水和硫酸溶液，均为8mol/L。

五氧化二磷定量显色剂：10%四水七钼酸铵溶液，异丁醇和苯等体积混合物，以脱醛乙醇为溶剂的2%硫酸溶液，以浓盐酸为溶剂的25%二氯化锡溶液，1mol/L硫酸，临用当天向100毫升1mol/L硫酸溶液中加入0.5毫升二氯化锡溶液作为还原剂，此溶液保质期为一天。

标准液：用试剂级物质来制备以下标准液，除六水三聚磷酸钠外，都要进行重结晶，三偏磷酸钠，重结晶两次并在110℃烘干，四水合四偏磷酸钠，重结晶一次。

A偏磷酸盐标准液：溶解0.7g十水焦磷酸四钠于100毫升水中；

B正磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐、三偏磷酸盐混合标液：溶解0.4g磷酸二氢钾、0.7g十水焦磷酸四钠、0.5g六水合三聚磷酸钠、0.35g三偏磷酸钠[（NaPO₃）₃]于250毫升水中。

C制备方法与B基本相同，只是另加0.4g四水合四偏磷酸钠。

主要技术

样品重量，短程纸层析每个样品点最大测量能力为10γ的总磷。每个样品点使用溶液最合适的体积为5μL，因此样品溶液的总磷浓度应为2γ/μL或者更少一些。对于更稀的样品溶液，可以在上一次滴加的液体完全干后，在同一点重复滴加5μL的溶液，在定量分析中，微量吸管必须准确接触到样品点的中心位置，在不损坏层析纸的情况下，最多可以重复滴加15次样品溶液，这意味着同一样品点可以加0.075毫升样液，而斑点不会扩大。

展开剂的前处理

由于两次展开可以得到更好的层析谱图，我们可以对展开剂进行预处理以进行两次展开，带有样品斑点的层析纸在后面所述的过程中被重复使用，展开剂可以用于3-4次层析过程，然后更换新的展开剂。

实验过程

把层析纸剪成9英寸宽、6或9英寸高（跟据分析需求而定），避免污染。用普通铅笔标记样品和参比的起始线和起始点。准备好后，将层析纸平放于无尘的环境中。

层析开始之前，将准备好的层析纸卷成圆柱形，用铂金丝固定，防止边缘接触。用微量吸管将样品和参比溶液分别滴加在起始点，然后干燥几分钟。将滴有样品溶液的圆筒形层析纸放在一个大的容器内，容器内放置一个烧杯，烧杯内装展开剂，将整个体系密封，平衡45分钟，避免展开剂液滴溅到层析纸上。

平衡结束后，小心将起点端浸入另一装有150毫升展开剂的容器中，加入时一定要小心，避免振动，密封，不能再移动容器。层析纸的上部不能相互接触。150毫升展开剂形成的液面高度约为3/8英寸高，样品和参比的起始点，都要距离层析纸底部一英寸以上，这样样品点就不会浸没在展开剂中。

展开结束后，将圆筒形层析纸取出，将上部两个角轻轻折叠，变成圆锥形。层析纸上残留的多余展开剂用纸巾在底部吸干。将层析纸立着放在纸巾上，放置10分钟。然后放在烘箱中50℃干燥10分钟。除去铂金丝，将层析纸铺平，在整个区域均匀的喷上显色剂溶液，必须喷成细雾状，层析纸上不能有液滴出现。将层析纸置于50℃烘箱中烘干10分钟，然后置于紫外灯下照射，直到显现出蓝色区域。如果层析纸被均匀的照射到，当参比样点清晰的显色后，此操作即可结束。

当斑点出现后，迅速用铅笔标记出来。标记线弯曲也没有关系。既要标记样品点，也要标记参比点。如果层析纸上的两个斑点靠的很近，用铅笔沿着颜色最浅的地方做标记。当使用酸性展开剂单向展开分析时，焦磷酸和三聚磷酸之间的线要尽量靠近焦磷酸组分区域，因为在这些情况下，通常由经验判断校正值。正磷酸与焦磷酸组分之间的区分线，平分这两种组分之间的层析纸空白部分。在为区分环状聚磷酸与链状聚磷酸的双向层析中，以环状聚磷酸和链状聚磷酸斑点的中间部分画区分线。如果某一组分太弱不能显示，参考参比样点在相应位置标记。

对于简单洗脱法来说，控制组分斑点的面积在1/4平方英寸内较好，定量分析时还要标记出不含磷组分的3平方英寸的区域，作为试样空白。把每个区域单独剪碎成约1/8平方英寸的纸条，注意避免损失样品。把这些碎片卷起来，均匀、紧密的放入一个小漏斗中，漏斗颈插入25毫升的容量瓶中，加入一根弯曲的铂金丝，防止气流不通畅。用几滴水润湿漏斗中的纸条，然后用弯曲的铂金丝将纸条向下推，使其形成柱形。调整纸条的紧密程度，再滴加水润洗，使得每分钟滴下一滴水。加4滴8mol/L氨水开始洗脱，当氨水渗入纸条中后，立即再加4滴纯水。以上氨-水处理重复三次，然后再用几滴纯水洗涤两次。再用8mol/L硫酸代替氨水，重复上述操作。使用等体积的氨水和硫酸进行洗涤，最终得到的洗出液近中性。用水洗涤层析纸条五次，移去漏斗，向洗出液中加入2毫升8mol/L硫酸，准备进行水解。

不洗脱的处理方式，将样品斑点区域剪到小于1/4平方英寸，并掺入一些空白的层析纸，一并剪碎（剪成大概0.5英寸长、0.1英寸宽的碎片）。转移到25毫升容量瓶中，加入1毫升8mol/L氨水和7毫升纯水，振荡，然后放置5-10分钟，加入3毫升8mol/L硫酸，其中1毫升用来中和前面加入的氨水，2毫升使体系变成酸性，以利于水解反应的进行。各个组分的样品斑点必须同步处理，以保证处理的一致性。

水解和显色

装有所有磷酸盐强酸性溶液的25毫升容量瓶，置于沸水浴中20分钟。虽然正磷酸组分不需要水解，还是对其进行水浴以使得处理过程一致。这个20分钟的水解过程使得所有的聚合磷酸盐都水解为正磷酸盐。将容量瓶取出冷却，各准确加入10毫升苯-异丁醇混合液，然后加入2毫升10%钼酸铵溶液，用水定容至25毫升，然后剧烈振荡以萃取磷钼酸铵复合物。分层之后，准确吸取上层有机层5毫升，置于另一25毫升容量瓶中，加入约10毫升硫酸-乙醇溶液，再加入1毫升还原剂（二氯化锡溶液）。振荡，用硫酸-乙醇溶液定容，振荡使其均匀。放置10分钟后，在650nm处读取吸光值，用试剂空白做参比进行吸光值测量，将各组分的吸光值加和，得到总磷的吸光值。用各组分的吸光值除以总磷的吸光值，即得到各组分的百分数。

特殊处理

环状和短链磷酸盐的定量分析。在Ebel描述的双向层析分析中，Rf值受实验条件影响很大，尤其是在碱性展开剂中。因此，实验条件控制不够精确时，未知物的反向层析较难实现。通过加入焦磷酸做内标，同时在酸性展开剂中使用已知组成的混合物做参比，可以克服这个困难，焦磷酸的加入可以使环状磷酸盐-正磷酸盐的斑点与短链磷酸的斑点之间界线分明，在用碱性展开剂展开之后再加入参比。通过在同一张层析纸上展开的参比样品，获得正磷酸、焦磷酸和三聚磷酸的Rf值。

操作过程：对于每个样品，使用两张层析纸，在相邻两边，距纸边缘1英寸处各画一条铅笔线，这两条线的交点就是展开的起始点。把每张层析纸卷成圆柱形，用铂金丝固定好。准确滴加2微升参比A（只含焦磷酸）溶液在一张层析纸的起点上，等这张层析纸干透，在两张层析纸的起点处，各加5微升样品溶液，将层析纸置于碱性展开剂中展开8-9小时，在这个过程中，各组分沿着铅笔线上升，又成为下一次展开的起点线。纸干透后，移去铂金丝，打开圆柱形纸筒，测量溶剂前沿的高度，将层析纸上面三分之一被展开剂渗透的部分标记好，作为参比区域。在该区域中，距离起点线1英寸处标记两个样点以进行第二次展开。再次将层析纸卷成圆筒形，起点线在圆筒底部。在标记的样品点加5微升标准样品C，用酸性展开剂展开8-9个小时，然后按前述步骤进行显色。图1是这样处理的一个例子。

定量计算

在加有标准样品A的层析纸上，通过焦磷酸样点画一条线（如图1），通过标准样品点来区分环状磷酸盐与链状磷酸盐，它们的显色点在图1中有清晰的标示。

四聚磷酸盐的斑点很靠近三聚磷酸盐，而五聚磷酸盐很靠近四聚磷酸盐。为了标记移动很慢的六聚和七聚磷酸盐，用链长（1、2、3……）-logRf做标准曲线，然后对该曲线进行外推，得到更高链长的聚磷酸的Rf数据，进而在层析纸上找到未知样品点所对应组分的链长。第二张层析纸用来识别待测样品中的焦磷酸盐组分，并对污染等因素引起的指纹图谱进行校正。

已得到的磷酸混合标液各组分的Rf标准值在表1中，由于实验方法的不同，酸性展开剂中的Rf值有两组，Grunze和Thilo发现，logRf与聚磷酸聚合度呈线性相关。

半定量计算

把样品斑点剪下，参考前述定量分析方法进行处理。因为样品中磷酸盐重量在10γ以下，显色过程中的误差可能有几个百分点。

碱性三聚磷酸盐的定量试验

将1.5g样品溶解于250毫升去离子水中，并搅拌均匀。用酸性展开剂进行单向纸层析，得到了正磷酸、焦磷酸和更长链聚磷酸的百分比。单独进行双向层析以分离环状聚磷酸，双向层析是先在碱性展开剂后在酸性展开剂中进行的。

单向层析。准备一张9*6英寸的层析纸，标记好样品和空白区域，在起点的x处加5微升样品溶液，在R1和R2处加5微升标准溶液B。图2中层析纸的左右两部分各代表一个样品分析处理，分析是在室温下酸性展开剂中展开2.5小时，得到的三聚磷酸组分中包含了环状三磷酸组分，定量操作方法按照前面所描述的进行。为校正展开过程中三聚磷酸盐水解引起的误差，三聚磷酸盐的量调整0.3%/小时。焦磷酸盐的量扣除相应的数值。

双向层析。准备一张9*6英寸的层析纸，按照图3中进行标记。在x、R1、R2、R3处分别滴加5微升样品溶液和标准溶液B，25℃下在碱性展开剂中展开4-5小时。将层析纸取出，干燥，铺平，将载有标准液的条带按照图3中铅笔线剪下，喷上显色液显色，参考喷有标准液的层析纸，在未喷洒标准液的层析纸上用铅笔线标记磷酸盐组分的最大移动距离。沿此线上方3/4英寸处剪开，再卷成圆筒形，底部朝上，置于酸性展开剂中（不进行前处理），展开1.5小时。图案展开后，三聚磷酸盐组分呈现为带状，与其他磷酸盐组分截然分开，靠近之前剪下部分的边缘。环状磷酸盐在总磷中的百分比计算方法与前述相同。

结果

使用这个操作过程得到的一些典型数据列于表2中。第一个样品是高纯度的碱性正磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐的混合物。四次测试结果表明，纸层析法的精确性和重现性都较好。表2中的第二个分析表明，用纸层析法得到的检测数据与使用离子交换柱法测得的实验数据一致。其他数据是三聚磷酸盐的实验样品测试结果。

在短距离酸性展开剂中的纸层析不能将链状三聚磷酸和环状三聚磷酸分开。三聚磷酸组分常有拖尾现象，导致即使进行五小时的层析也无法彻底分开。环状三聚磷酸盐通常是包含在三聚磷酸盐组分中的，四聚磷酸盐组分也落在这个区域（三聚磷酸）中。如果使用这个方法分析短链组分，必须注意以下两点：（1）四聚磷酸盐和环状三聚磷酸盐都包含在三聚磷酸盐组分中，（2）五聚磷酸盐和四聚磷酸盐一样，可能出现在三聚磷酸盐组分中，也可能出现在不移动的组分中（六聚或更高的聚合度）。分析这些组分的正确方法是使用加速分离，并且需要引入水解校正系数。

用二维层析分析环状三聚磷酸盐的数据列于表3.溶液是通过溶解环状三聚磷酸盐标准品得到的，经色谱法分析，该标准品中含环状三聚磷酸盐90.5%，不等量的链状三聚磷酸盐。如果在单向层析中发现多于一种的不移动聚磷酸盐（长链）组分，在二维层析中，整张层析纸都必须用来测算总磷的含量。在这种情况下，碱性展开剂中的溶剂前沿不应超过起点线5英寸。这使得第二次层析中，短链组分十分接近第一次层析的起点线，回到原来长链组分所在的区域。在碱性展开剂中，四聚磷酸盐组分的移动速度比三聚磷酸盐组分慢，在酸性展开剂中也是如此。因为这两次层析的方向是相反的，两次层析后，环状三磷酸都在相同的区域。可以在酸性展开剂中进行第三次层析来分离这两种组分。

洗涤剂混合物中磷酸盐的分析

刚才描述的方法可以用来分析洗涤剂混合物中的磷酸盐含量。在这样的分析中，溶解3g样品在250毫升去离子水中。用5:1000的稀释倍数并完全水解来测定总磷。用纸层析法分析三聚磷酸钠。如果洗涤剂中的总磷含量小于5%，层析时第一次点样干燥后，重复点样一次。对不同的洗涤剂做了实验，发现虽然所含磷酸盐品种不同，该方法都不影响各组分的分离和定量分析。这个受干扰影响小的特性对于显色法分析含量十分有利。几种不同的洗涤剂分析结果见表5.这个方法对于分析洗涤剂生产中聚磷酸盐的降解非常有用。

在极稀溶液中不同磷酸盐组分的分析。

先使含碱性磷酸盐的中性溶液（总磷在50γ-100γ）在室温下蒸发。在直径4英寸的培养皿中放置一夜可以挥发掉10毫升水，使液面上的空气流动可以加快这个过程。用0.25毫升去离子水洗涤残留物，先把水平铺开，再倾斜培养皿使水流到一侧，用胶头滴管将洗涤液收集起来。将洗涤液分别滴在层析纸的两端，使用三聚磷酸盐的分析法进行分析，并引入水解校正系数。

表面水

取100毫升样品，加入1克Dowex-50树脂（钠盐）搅拌1小时。用Whatman 1号滤纸过滤，弃去最初25毫升滤液，取10毫升滤液置于培养皿中，使其蒸发干燥。用0.4毫升0.5%的乙二胺四乙酸二钠溶液处理残留物，后续处理与前面所述操作相同，只是点样时在起点线处多次滴加2微升溶液，而不是5微升。在标准液点R1和R2 处同时滴加样品液，在后续加样之前，层析纸必须彻底干燥。最后在标准样品点R（已经滴有样品溶液）上滴加标准溶液B。在酸性展开剂中展开3.5小时，后续按照三聚磷酸盐分析方式进行，引入水解校正系数。

不同浓度的极稀溶液磷含量分析结果见表5.这些分析是使用新制备的溶液做的，目的是为了避免复杂离子、粘土矿物、微量有机物质存在起到的催化作用，使得聚磷酸盐的水解反应快速进行。乙二胺二乙酸二钠的加入是为了避免磷酸钙沉淀析出，这是由于离子交换处理不可能除去全部的钙离子。乙二胺四乙酸二钠对于磷酸钙盐的增溶作用是被证实过的，加入乙二胺四乙酸二钠后，这些物质能够被带入溶液中，从而被纸层析法分析出来。

讨论

上升法纸层析用来分析聚磷酸盐各组分的适用范围有限。在快速分离直链聚磷酸适宜的pH范围内（pH1.5-1.7），较难通过测定Rf值有效的分离高分子量的聚磷酸盐，因为层析纸上90%以上的路径都被聚合度7以下的聚磷酸盐占据了。Grunze和Thilo也报道了同样的结论。由这些数据推算，聚合度15以上的聚磷酸盐移动距离不到溶剂前沿的1%，举例来说，如果使用250cm的层析纸，这些组分的移动距离约为1cm。使用递减层析法，使移动速度快的组分离开层析纸，可以解决这个问题。当然还需要对离开层析纸的成分进行分析，以确定磷酸盐组分的种类和含量。然而，这个方法需要的时间更长，聚磷酸盐的水解和层析过程中组分的扩散也给方法的使用带来了局限性。当使用碱性展开剂时，聚磷酸盐组分的分部稍好一些，但是直链聚磷酸组分的分离更慢，如果展开过程中有一点微扰，层析各组分的分析和定量将很困难。聚合度10以上的聚磷酸盐的纸层析仍然较难实现，还是使用离子交换法较好。另一方面，纸层析法对于分析正磷酸和低聚磷酸混合物是一个简便的方法。

在某种展开剂中，某一组分的聚磷酸盐的Rf值重现性并不好。它受以下因素影响：样品组成、层析纸材质、层析纸前处理方法、温度、展开过程、展开剂的精确组成、展开剂的使用次数等。层析时使用容器的的密封也很重要。Rf值还受样品中其他组分的影响，因此使用纯物质配制的标准品并不能真实反映样品中组分的移动情况。这被发现是非常重要的，尤其是在分析聚磷酸盐含量很低的高硬度的地表水时。

每张层析纸上都应加标准液。这个操作只需要几秒钟，却保证了磷酸盐组分分析的可靠性。标准溶液还被用来确定定量分析中低含量组分在层析纸上的位置。

通过衡量显色区域的面积和颜色深浅来评价磷酸盐组分的含量是不合适的，因为紫外灯下显色时，水解和降解都进行的不完全。定量是在将各组分剪下后进行的，最终是以各组分的百分数表示，这样可以避免点样时精确的衡量液体体积。洗脱步骤通常以稀释的氨水开始，因为磷钼酸复合物在酸中溶解度很低。样品的总磷是在各组分完全水解为正磷酸以后，将各组分加和得到的。

如果使用推荐的显色方法，可以省略各组分单独洗脱过程，而把他们保留在层析纸上，但是必须保证同一次分析中，各组分的处理方法相同。层析纸的存在不会影响水解过程。在用有机溶剂萃取磷钼酸复合物时，磷钼酸复合物并不是在水相和非水相之间分配，而是在三相之间分配：纤维、水相、有机溶剂混合物。这个效应减小了磷素在有机相中的含量，这会使得层析纸上各组分磷素的含量百分比都降低。可以通过以下方法避免：给各磷素组分分配相同的层析纸面积，在一次分析中将所有组分全部做完，以提高平行性，并且只计算各组分的百分率，而不计算绝对含量。微克级的各组分的测量准确度不及前面所述的各组分分别洗脱的方法。

只有在酸性展开剂中，链状聚磷酸盐可以令人满意的分离。层析过程中，聚磷酸盐会有部分水解，水解产物在层析纸上停留的位置取决于相应组分的Rf值和水解的时间。由于溶液中三聚磷酸水解成1mol焦磷酸和1mol正磷酸，在快速展开中，少于三分之一的三聚磷酸水解产物停留在焦磷酸区域内。通过尽量压缩层析时间、在室温下进行操作、并给予校正系数，水解产生的误差可以被减到最小。前面所提到的酸性展开剂中的单向层析校正是基于相同条件下不同时长的三次层析（2.5小时-10小时）。数据见图4.

在5小时或更低的层析时间中，发现焦磷酸组分的比例较高。这意味着，当使用推荐的剪开各组分的处理方法时，短距离层析时，大部分的水解产物都分布在焦磷酸区域内，对三聚磷酸和焦磷酸的校正是足够的。焦磷酸的水解和降解过程被认为远远慢于其他组分，在同样的酸度下，焦磷酸的稳定性是三聚磷酸的9倍。纸层析法定量分析中，认为水溶液中焦磷酸和三聚磷酸的水解速度相同。纸层析法中三聚磷酸的降解示于图4.纤维素并不能显著促进水解过程，可以通过已公开的数据计算校正系数。在酸性和碱性溶液中，环状磷酸盐的水解速度都相当快，因此这一项校正应当精确的进行。在这里描述的方法的精度范围内，使用与三聚磷酸相同的校正系数是有效的。

本文描述的方法要求，在酸性展开剂中进行的分离过程，时间越短越好。在25℃，层析2.5小时后，正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸以及更高聚合度的聚磷酸已经达到了理想的分离（图5）。对照区域可以很容易的被剪下来，校正值是很小的（小于1%），因此室温下使用的校正系数给结果带来的偏差较小。

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2012/9/8 8:59:53 Last edit by avachen