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主题：【第六届原创】【极限体验】盐酸坦洛新缓释片含量测定方法学

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发表于：2013/01/08 15:49:59 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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项目：含量测定（3.2.P.5.2.7）

检查方法：照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录Ⅴ D）测定

试验条件：

色谱柱（柱长：150mm，内径：4.6mm，填料：C₁₈，填料粒径：5μm）

UV检测器（检测波长：225nm）

柱温：30℃

流动相：0.2mol/L磷酸二氢钾-0.2mol/L磷酸-乙腈（7：7：5）

流速：1.0ml/min

运行时间：约25分钟

系统适用性：理论板数按盐酸坦洛新峰计算不低于2000。

具体试验操作：取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于盐酸坦洛新0.2mg)，置50ml量瓶中，加流动相适量振摇后超声使溶解，放冷至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液20μl注入液相色谱仪中，记录色谱图；另精密称取盐酸坦洛新对照品2mg置50ml量瓶中，加流动相振摇后超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为对照品溶液，精密量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪中，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。

计算公式：

标示量百分含量（%）=××100%

式中：C_s为对照品的浓度（mg/ml）；

A_t为供试液的主峰面积；

N_t为供试液的稀释倍数；

A_S为对照品溶液的主峰面积；

W为供试品取样量（mg）。

3.2.P.5.3.5含量测定

含量测定方法学验证结果概要

项目	验证结果
波长选择	225nm。
流动相选择	0.2mol/L磷酸二氢钾-0.2mol/L磷酸-乙腈（7：7：5）。
进样精密度试验	连续测量6次，主峰保留时间和峰面积RSD均小于2.0%。
线性关系试验	浓度在2460ng/ml～5740ng/ml，直线方程为y=107.8x﹢5880.1，R2=0.9992，相关系数r=0.9996，截距为5880，小于100%浓度溶液主峰面积的2.0%（8841）。
溶液稳定性试验	室温条件下置12个小时，测得峰面积的RSD为1.3%
回收率试验	平均回收率为100.3%，在98.0%～102.0%范围内，RSD为1.0%（n=9），小于2.0%。
重复性试验	试验结果在95.3%～100.5，RSD值为2.0%。
耐用性	同有关物质项
含量测定结果	上市品和自制品均符合规定

3.2.P.5.3.5.1波长选择

参照盐酸坦洛新缓释片药品质量标准YBH19552005含量测定项、盐酸坦洛新原料药质量标准YBH03262005有关物质项和本品有关物质研究试验结果，检测波长选定为225nm。

3.2.P.5.3.5.2流动相选择(色谱图见附件941～955)

参照盐酸坦洛新缓释片药品质量标准YBH19552005和原料药质量标准YBH03262005中流动相体系。

流动相体系

编号	流动相组成体系及试验条件
1-1	乙腈-甲醇-磷酸溶液（取三乙胺、磷酸各1ml，加水至200ml）（20:30:50），检测波长223nm。
1-2	乙腈-甲醇-磷酸溶液（取三乙胺、磷酸各1ml，加水至200ml）（15:30:55），检测波长223nm。
1-3	乙腈-甲醇-磷酸溶液（取三乙胺、磷酸各1ml，加水至200ml）（10:15:75），检测波长223nm。
1-4	乙腈-甲醇-磷酸溶液（取三乙胺、磷酸各1ml，加水至200ml）（10:30:60），检测波长223nm。
2	0.2mol/L磷酸二氢钾-0.2mol/L磷酸-乙腈（7:7:5），检测波长225nm。

备注：流动相1-1～1-4参考盐酸坦洛新缓释片药品质量标准YBH19552005；

流动相2参考盐酸坦洛新原料药质量标准YBH03262005。

参照上述流动相体系，进行含量测定流动相选择试验。结果见下表图：

流动相选择试验结果

编号	试验项目	主峰保留时间（min）	拖尾因子	主峰面积	分离度	理论板数	备注
1-1.	样品1	4.906	1.111	240352	7.711	4363
1-1.	样品2	4.887	1.117	288876	5.783	4364
1-2.	样品	4.778	1.189	197253	6.274	3999
1-3.	样品	32.705	1.018	186682	20.778	5969
1-4.	样品	10.172	1.102	1264110	12.311	5086
2.	样品1	13.368	1.044	1729155	7.493	11211
2.	样品2	13.369	1.041	1446237	7.247	11075
2.	样品3	14.235	0.887	807624	1.790	7339
2.	样品4	14.302	1.034	898923	1.824	10809
2.	样品5	14.350	1.029	1091913	1.938	11713
2.	样品6	14.351	1.025	935584	2.036	11859
2.	样品7	14.316	1.153	6077271	1.817	11494
2.	样品8	14.300	1.088	3518863	1.850	11877
2.	原料药	13.014	2.205	47090198	4.473	6716

备注：表格中“-”为未统计或无内容。

试验结果典型色谱图：

编号1-1.色谱图（见附件941～942）

备注：色谱图从上至下信息为样品1、样品2。

结果表明，盐酸坦洛新主峰保留时间为5分钟，较溶剂峰近，基线漂移较大。

编号1-2.试验结果（见附件943～944）

原料药供试液色谱图信息

峰#	名称	保留时间	面积	拖尾因子	分离度	理论塔板#	面积%
1	溶剂	2.904	41802	2.187	-	1547	17.347
2	盐酸坦洛新	4.778	197253	1.189	6.274	3999	81.858
3	杂质	12.854	1914	1.306	18.737	8437	0.794

试验结果表明，溶剂峰和盐酸坦洛新主峰保留时间较近，此流动相溶解样品前处理较难溶，不适合含量测定。

编号1-3.试验结果（见附件945）

原料药供试液色谱图信息

峰#	名称	保留时间	面积	拖尾因子	分离度	理论塔板#	面积%
1	溶剂	2.782	12183	-	-	1231	4.9129
2	-	3.054	40872	2.175	1.060	3924	16.4825
3	-	4.039	2006	-	5.641	10959	0.8090
4	-	4.162	4724	-	0.470	2043	1.9051
5	-	9.534	1506	0.745	11.867	5041	0.6073
6	盐酸坦洛新	32.705	186682	1.018	20.778	5969	75.2832

试验结果表明，此流动相溶解样品前处理较难溶，不适合含量测定。

编号1-4.试验结果（见附件946）

原料药供试液色谱图信息

峰#	名称	保留时间	面积	拖尾因子	分离度	理论塔板#	面积%
1	溶剂	2.563	2957	-	-	196	0.2166
2	溶剂	2.811	9345	-	0.313	174	0.6844
3	溶剂	3.011	51823	-	0.341	1399	3.7956
4	-	3.308	13605	-	0.137	10	0.9964
5	-	3.578	11623	-	0.115	437	0.8513
6	-	3.847	9208	--	0.509	1693	0.6744
7	-	4.339	2685	--	1.312	2119	0.1967
8	盐酸坦洛新	10.172	1264110	1.102	12.311	5086	92.5846

试验结果表明，此流动相溶解样品前处理较难溶，不适合含量测定。

编号2.样品1试验结果（见附件947）

样品1供试液色谱图信息

峰#	名称	保留时间	面积	拖尾因子	分离度	理论塔板#	面积%
14	盐酸坦洛新	13.368	1729155	1.044	7.493	11211.650	94.3531

备注：取盐酸坦洛新缓释片1片，置10ml量瓶中，加2ml甲醇，振摇，超声使溶解，加流动相稀释至刻度。

试验结果表明，此流动相适合含量测定。

编号2.样品2～样品6试验结果（见附件948～955）

供试液制备：

样品2：取盐酸坦洛新缓释片细粉0.0506g，置10ml量瓶中，加5ml甲醇，振摇，超声使溶解，加流动相稀释至刻度；

样品3：取盐酸坦洛新缓释片细粉0.0502g，置10ml量瓶中，加5ml甲醇，振摇，超声使溶解，加甲醇稀释至刻度；

样品4：取盐酸坦洛新缓释片细粉0.0503g，置10ml量瓶中，加7ml甲醇，振摇，超声使溶解，加流动相稀释至刻度；

样品5：取盐酸坦洛新缓释片细粉0.0507g，置10ml量瓶中，加2ml甲醇，振摇，超声使溶解，加流动相稀释至刻度；

样品6：取盐酸坦洛新缓释片细粉0.0505g，置10ml量瓶中，加流动相振摇，超声使溶解，加流动相稀释至刻度；

样品7：取盐酸坦洛新缓释片细粉0.5041g，置10ml量瓶中，加流动相振摇，超声使溶解，加流动相稀释至刻度；

样品8：取盐酸坦洛新缓释片细粉0.2512g，置10ml量瓶中，加流动相振摇，超声使溶解，加流动相稀释至刻度；

样品9：取盐酸坦洛新原料药0.00534g，置10ml量瓶中，加流动相振摇，超声使溶解，加流动相稀释至刻度；

原料药供试液色谱图信息

样品	名称	保留时间	面积	拖尾因子	分离度	理论塔板#	面积%
2	盐酸坦洛新	13.369	1446237	1.041	7.247	11075.431	65.3408
3	盐酸坦洛新	14.235	807624	0.887	1.790	7339.871	85.7722
4	盐酸坦洛新	14.302	898923	1.034	1.824	10809.272	97.6813
5	盐酸坦洛新	14.350	1091913	1.029	1.938	11713.496	83.2610
6	盐酸坦洛新	14.351	935584	1.025	2.036	11859.015	92.2088
7	盐酸坦洛新	14.316	6077271	1.153	1.817	11494.955	93.8650
8	盐酸坦洛新	14.300	3518863	1.088	1.850	11877.850	92.2367
9	盐酸坦洛新	13.014	47090198	2.205	4.473	6716.910	99.9549

备注：色谱图从上至下信息为样品2～样品9。

以上试验结果表明，采用流动相体系为乙腈-甲醇-磷酸溶液（取三乙胺、磷酸各1ml，加水至200ml），盐酸坦洛新主峰保留时间和溶剂峰较近或出峰时间较较迟；而采用流动相体系为0.2mol/L磷酸二氢钾-0.2mol/L磷酸-乙腈，盐酸坦洛新主峰保留时间在约14分钟，且流动相能较好溶解样品，适合含量测定。

3.2.P.5.3.5.3进样精密度试验(色谱图见附件956～961)

精密称取盐酸坦洛新原料药（批号：YK1111001）0.00820g，置100ml量瓶中，用流动相适量超声使溶解，放冷至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液5ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试液，精密量取供试液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，重复操作6次。试验结果见下表。

精密度试验结果

进针次数	1	2	3	4	5	6	平均	RSD%
保留时间（min）	14.055	14.083	14.081	14.088	14.109	14.095	14.085	0.1
主峰面积（A）	436349	445253	446141	445474	446024	447429	444445	0.9

试验结果表明，连续测量6次，主峰保留时间和峰面积RSD%均小于2.0%，进样精密度符合要求。

3.2.P.5.3.5.4含量测定线性关系试验(色谱图见附件962～966)

精密称取对照品（规格：50mg，批号：100688-200401，含量：100.0%）0.00820g，置100ml量瓶中，用流动相适量超声使溶解，放冷至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液3、4、5、6、7ml分别置于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试液。取上述供试液各20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见下表。

线性关系试验结果

浓度（%）	60%	80%	100%	120%	140%
浓度（ng/ml）	2460	3280	4100	4920	5740
峰面积（A）	272671	362044	442069	533835	628774

试验结果经线性回归分析，浓度在2460ng/ml～5740ng/ml，直线方程为y=107.8x﹢5880.1，R²=0.9992，相关系数r=0.9996，截距为5880，小于100%浓度溶液主峰面积的2.0%（8841），表明线性关系试验符合要求。

3.2.P.5.3.5.5溶液稳定性试验(色谱图见附件967～973)

取本品（规格：0.2mg，批号：20120401）细粉0.1327g，置50ml量瓶中，用流动相适量超声使溶解，放冷至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液在室温条件下放置12h，分别于0、2、4、6、8、10、12h取上述溶液各20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见下表。

溶液稳定性试验结果

时间	0h	2h	4h	6h	8h	10h	12h	平均值	RSD
峰面积	360813	361077	363528	369365	371544	370178	370921	366775	1.3%

本品的流动相溶液在室温条件下置12个小时，测得主峰面积的RSD为1.3%，小于2.0%，试验结果表明盐酸坦洛新供试液较稳定。

3.2.P.5.3.5.6回收率试验(色谱图见附件974～994)

按70%、100%、130%的份量，各精密称取盐酸坦洛新（含量：99.0%，水分0.05%）三份，按处方量加入混合辅料约1.29g，分别置50ml量瓶中，加流动相适量超声使溶解，放冷至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，分别精密量取续滤液1ml置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，各取20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见下表。

回收率试验测定结果

标示量	加入量(mg)	测得量(mg)	回收率(%)	平均值（%）	RSD（%）
70%	1.48	1.485	100.3	100.3	1.0%
	1.47	1.470	100.0
	1.49	1.484	99.6
100%	2.09	2.096	100.3
	2.05	2.048	99.9
	2.09	2.109	100.9
130%	2.61	2.572	98.5
	2.75	2.800	101.8
	2.73	2.775	101.6

试验结果表明，平均回收率为100.3%，在98.0%～102.0%范围内，RSD为1.0%（n=9），小于2.0%，回收率符合含量测定方法验证要求。

3.2.P.5.3.5.7重复性试验(色谱图见附件995～1010)

精密称取本品（规格：0.2mg，批号：20120401）细粉6份，分别置50 ml量瓶中，加流动相适量振摇后，超声使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见下表。

重复性试验结果（%）

1	2	3	4	5	6	平均值	RSD
95.83	96.87	95.33	100.62	96.28	96.35	96.9	1.97

试验结果表明，重复性试验结果在95.3%～100.5%，RSD值为2.0%，符合重复性试验要求。

3.2.P.5.3.5.8含量测定方法的确定

根据含量方法学试验结果并参照盐酸坦洛新原料药质量试行标准YBH03262005有关物质项和盐酸坦洛新缓释片质量标准YBH19552005含量项，确定本品含量测定方法如下：

照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录Ⅴ D）测定。

色谱条件与系统适用性试验 用十八烷键合硅胶为填充剂；0.2mol/L磷酸二氢钾-0.2mol/L磷酸-乙腈（7：7：5）为流动相，检测波长为225nm，理论塔板数按盐酸坦洛新峰计算，应不低于2000。

测定法取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于盐酸坦洛新0.2mg)，置50ml量瓶中，加流动相适量振摇后超声使溶解，放冷至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液20μl注入液相色谱仪中，记录色谱图；另精密称取盐酸坦洛新对照品2mg置50ml量瓶中，加流动相振摇后超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为对照品溶液，精密量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪中，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。

3.2.P.5.3.5.9含量测定色谱条件耐用性

因本品含量测定与有关物质检查色谱条件一致，耐用性试验结果见有关物质方法学验证项3.2.P.5.3.2.9耐用性试验项。

3.2.P.5.3.5.10含量测定结果

参照中国药典2010年版二部对制剂含量限度的一般要求，并结合本品含量测定结果，将本品含量限度拟定为：本品含盐酸坦洛新（C₂₀H₂₈N₂O₅S•HCl）应为标示量的90.0%～110%。取本品各批，按上述方法对自制品和上市样品进行检测，结果均符合规定，结果见下表。

含量测定结果（%）

批号	测定结果	含量测定色谱图编号	含量均匀度色谱图编号
20120401	96.9	995～1010	1031～1054
20120701	99.8	1011～1018	1055～1078
20120702	100.3	1019～1022	1079～1103
20120703	99.4	1023～1026	1104～1127
120201	99.8	1027～1030	-