毛细管导电聚焦法 ( C mF ) C l E F法可用于分离等电点 ( P I )相差0 ． 1 2 p H单位的蛋白质，其基本步骤是：先在 毛细管内对蛋白质进行等电聚焦，然后对分离的蛋白质区带进行检测，按照迁移技术的 不同，分离方法可分为两步法、一步法、固定区带法。C l E F分离蛋白质应先解决基本 问题：消除或减少电渗的涂层方法、检测方法和条件，蛋白质区带的迁移及 P I测定方法，影响C I E F分离效能的因素，两性电解质的组成和浓度、毛细管长度、聚焦电压等。
凯氏( K j e l d a h 1 ) 定氮法 将被测试的样品与浓硫酸在硫酸铜和硫酸钾存在下共热消化， 含氮有机物即分解产生氨、二氧化碳和水， 氨与硫酸反应变成硫酸铵。消化后向消化液中加入强碱碱化使之分解放出氨，用水蒸气将氨蒸至硼酸液中， 用标准强酸溶液滴定收集氨的硼酸溶液， 即可计算出样品的氮含量， 从而折算出样品的蛋白质含量( 通常由含氮量乘以系数 6 ． 2 5计算出( 该系数为蛋白质平均含氮量的倒数) ， 乳制品通过乘以系数 6 ． 3 8计算出( 该系数为乳制品中蛋白质含氮量的倒 数) ) 。这种方法是K j e l d a h l 在 1 8 8 3年发明的， 当时他只使用硫酸分解试样， 测定谷物中的蛋白含量， 需要较长的反应时间。后来 G u n n i n g 搞清楚了消化机理， 在消化时加入 K s O 使反应温度由原来的3 8 0 ~ C( 硫酸沸点) 上升到4 0 0 ~ C， 并加入硫酸铜为催化剂， 提高了消化速度， 改进了凯氏定氮法。该方法的缺点是耗时长， 灵敏度低， 样品中的含氮化合物会影响蛋白含量的测定。要想准确测定出蛋白含量， 可以先测定出总含氮量。再用三氯乙酸将样品溶液中的蛋白沉淀除去， 然后测定溶液的非蛋白含氮量， 最后从总含氮量中扣除非蛋白含氮量就可以比较准确地测定出样品的真正蛋白含量。
双缩脲法 ( B i u r e t 法) 双缩脲( N H C O N H C O N H ) 是两分子的脲经 1 8 0 o C左右加热， 放出一分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中， 双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物， 称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键， 或间隔一个碳原子相连的肽键结构的化合物都可以发生双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比， 而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关， 可用来测 定蛋白质含量。测定范围为 1～1 0 mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有： 硫酸铵、 T r i s 缓冲 液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速， 不同的蛋白质产生颜色的深浅相近， 以及干扰物质 少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速、 但并不需要十分精确的蛋白质测定。
F o l i n - 酚试剂法( L o wr y法) F o l i n ． 酚试剂法( L o w r y法) 是由L o w r y在双缩脲方法的基础上发展的。他在双缩脲试剂的基础上又增加了一种增强显色的试剂——磷钼酸和磷钨酸的混合液， 它们被蛋白质中酪氨酸残基的酚羟基还原， 产生深蓝色( 钼蓝和钨蓝的混合物) ， 以增加显色量， 从而提高了检测蛋白 质的灵敏度。该测定法的优点是灵敏度高， 比双缩脲法灵敏得多， 此法可检测的最低蛋白质量达5 1 x g 。通常测定范围是2 0— 2 5 0 p ． g 。缺点是费时较长， 要精确控制操作时间。因L ow r y 反应的显色随时间不断加深， 因此各项操作必须精确控制时间， 标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差， 干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子， 同样容易干扰 L ow r y反应， 而且对后者的影响更大。酚类、 柠檬酸、 硫酸铵、 T r i s 缓冲液、 甘氨酸、 糖类、 甘油等均有干扰作用。由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸， 显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度( 相对于标准蛋白质) 。
考马斯亮蓝法( B r a d f o r d法) 双缩脲法和 F o l i n 一 酚试剂法的明显缺点和使用限制， 促使科学家去寻找更好的蛋白质含量测定方法。1 9 7 6年， 由B r a d f o r d建立的考马斯亮蓝法( B r a d fo r d法) 是根据考马斯亮蓝G- 2 5 0染料在酸性溶液中与蛋白质中的碱性氨基酸( 特别是精氨酸) 及芳香族氨基酸残基相结合， 使染料最大吸收峰的位置( A ) 由4 6 5 n m变为 5 9 5 n m， 溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色的原理设计的l _ 4 j 。在 5 9 5 n m下测定的吸光度值与蛋白质浓度成正比。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法， 因而正在得到广泛的应用。 考马斯亮蓝法的突出优点是： ( 1 )灵敏度高， 比 L ow r y法约高 4倍， 最低蛋白质检测量可达 1 I x g 。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大， 蛋白质- 染料复合物有更高的消光系数。( 2 )测定快速、 简便， 只需加一种试剂。完成一个样品的测定一般只需要 5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程大约只要 2分钟即可完成 ， 其颜色可以在 1小时内保持稳定， 且在5分钟至2 0分钟之间， 颜色的稳定性最好。因而完全不用像 L ow r y 法那样费时和严格地控制时间。( 3 )干扰物质少。如干扰 L ow r y法的 K 、 N a 、 M g 、 r i f f s 缓冲液、 糖和蔗糖、甘油、 巯基乙醇、 E D T A等均不干扰此测定法。 此法的缺点是： ( I )由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同， 因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。( 2 )主要的干扰物质有： 去污剂、 T r i t o n X 一 1 0 0 、 十二烷基硫酸钠( S D S ) 和0 ． I mo l ／ L的N a O H。( 3 )标准曲线有轻微的非线性 ， 因而不能用 B e e r 定律进行计算， 而只能用标准曲线来测定。
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