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主题：【求助】氨基酸分析包使用

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tiantaishan
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发表于：2013/05/15 22:37:52 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
使用氨基酸分析包，做标样两平行，衍生后，每个样品重复进样4次，第一个样品前3次保留时间都不稳定，面积误差也较大（特别是保留时间长的峰），第二个样也重复4次，保留时间和峰面积重复性均较好。估计是三乙胺吸附和异硫氰酸苯酯影响。

有个问题就是，三乙胺能否换为氨水和氯化铵的缓冲溶液，衍生后，正己烷萃取增为两次，除去（异硫氰酸苯酯，杂质）效果是否更好些？取200微升加水800微升是否可以换为800微升流动相A？？
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2013/5/22 12:13:13 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
我也遇到过这个问题，当时使用我们实验室的柱子做的时候第一针保留时间不稳定，第2针以后保留就稳定了，怀疑是色谱柱没有平衡好，后来我们排样的时候就都不对第一针做任何评价了。
    三乙胺换成氨水，这个没有尝试过，不过个人觉得氨水应该较好吧？
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huangdm
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2013/5/22 20:46:12 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
分析什么里面的氨基酸啊？
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tiantaishan
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2013/5/23 19:05:44 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
只是标样，不是样品；色谱柱用初始流动相冲洗了差不多1小时；使用前用乙腈冲洗了2小时以上，然后用10%乙腈水溶液冲洗了半小时以上，最后换为初始流动相。液相为安捷伦1200。色谱柱是新柱初次使用。

很多资料说三乙胺在色谱柱上有吸附无法完全洗脱，用大致30mmol乙酸乙腈水溶液可以洗拖。如果的确如此，换句话也就是说吸附的三乙胺洗脱后就会导致保留时间漂移。由于是分析包，量少，价格也贵，也没法去验证氨水效果如何（尽管衍生物水溶性不好，但体系是乙腈，少量的氨水氯化铵也不存在这个问题）

很多资料都评价液相色谱柱前衍生方法重复性不好，从而氨基酸分析仪是仲裁方法（其实也就是离子色谱法）。没有做过样品，不知道是事实还是具有话语权人的一家之言
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lousha
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2013/5/24 0:01:39 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 tiantaishan(tiantaishan) 发表:
使用氨基酸分析包，做标样两平行，衍生后，每个样品重复进样4次，第一个样品前3次保留时间都不稳定，面积误差也较大（特别是保留时间长的峰），第二个样也重复4次，保留时间和峰面积重复性均较好。估计是三乙胺吸附和异硫氰酸苯酯影响。

有个问题就是，三乙胺能否换为氨水和氯化铵的缓冲溶液，衍生后，正己烷萃取增为两次，除去（异硫氰酸苯酯，杂质）效果是否更好些？取200微升加水800微升是否可以换为800微升流动相A？？


非常抱歉tiantianshan,我出差到了一个居然没有wifi的地方,不像是21世纪呀,

以下建议,希望能对您有帮助哦

保留时间不稳定可能是用于分离的色谱柱没平衡好造成，与三乙胺和异硫氰酸苯酯没关系。

色谱柱使用前可使用100%的流动相B先以1ml/min的流速冲洗15min后用流动相A平衡。

    三乙胺不能换为氨水和氯化铵的缓冲溶液，因为即使多萃取几次也不能完全去除异硫氰酸苯酯，如果缓冲溶液含有氨水和氯化铵，那么进样后，铵离子会不断与样品中残留的异硫氰酸苯酯发生反应，反应产生的产物可能干扰测定。取200微升加水800微升应该可以换为800微升流动相A。加水稀释的目的是为了降低样品中的有机溶剂浓度，减少溶剂效应，防止先被洗脱的门冬氨酸和谷氨酸峰分叉，同时提高两个氨基酸峰的检出灵敏度，仅此目的而已。如果进2ul样品溶液不会出现门冬氨酸和谷氨酸峰出现分叉的现象的话，也可以不稀释。

不用谢谢我了,我已经晚回复您的问题了,

记得给我一个好评哟,亲
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tiantaishan
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2013/5/24 11:08:35 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
谢谢，但色谱柱应该是平衡了的，冲洗时间超过了1小时以上。进样时，前三针保留时间差异都比较大，特别是保留时间长的化合物，峰面积重复性都是很好。后4针保留时间才稳定下来，重复性也可以。氨水中的氨是可以和异硫氰酸苯酯反应，但不知道稳定性如何。酸性条件下，基本不反应，这也是氨基酸衍生在三乙胺碱性条件下反应的原理。

主要的问题是此方法除了样品检测灵敏度不高，很多地方都说液相检测柱前衍生重复性不好，衍生条件控制好应该没问题，液相分离也不存在问题，怎么会重复性不好？？？
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雪山飞狐
wangfei_0124
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2013/5/25 13:00:53 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
都是用三乙胺的，不知道能不能换啊
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博纳艾杰尔
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2013/5/27 9:09:58 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 tiantaishan(tiantaishan) 发表:
谢谢，但色谱柱应该是平衡了的，冲洗时间超过了1小时以上。进样时，前三针保留时间差异都比较大，特别是保留时间长的化合物，峰面积重复性都是很好。后4针保留时间才稳定下来，重复性也可以。氨水中的氨是可以和异硫氰酸苯酯反应，但不知道稳定性如何。酸性条件下，基本不反应，这也是氨基酸衍生在三乙胺碱性条件下反应的原理。

主要的问题是此方法除了样品检测灵敏度不高，很多地方都说液相检测柱前衍生重复性不好，衍生条件控制好应该没问题，液相分离也不存在问题，怎么会重复性不好？？？


版友您好。就您的问题，我们和资深专家进行了一些沟通，他的意见如下，供您参考，谢谢！

关于“三乙胺能否换为氨水和氯化铵的缓冲溶液使用氨基酸分析包”的问题，准确的说应该理解为“不能用氨水会氯化铵代替三乙胺，因为铵离子会与异硫氰酸苯酯发生反应，因此在衍生过程中一旦加入异硫氰酸苯酯后，缓冲液中的铵离子就会和样品中的氨基酸一起与异硫氰酸苯酯发生反应，分离时在色谱图中产生一个很大的峰，干扰分离”。铵离子的反应产物比较稳定。从前三针进样峰的保留时间和峰面积不稳定而第四针以后比较稳定的现象来看，我认为还是色谱柱没平衡好的原因造成的，可能是刚开始时色谱柱中的分离状态不好，经过几次分析后在有机相的作用下，色谱柱中的分离状态变好了，因此保留时间和峰面积就稳定了。

不知道您所说的”冲洗时间超过了1小时以上”，是用流动相A还是流动相B冲洗的，如果用流动相A冲洗的话，有可能出现您之前所述的情况，因为流动相A中含有机相较少，不容易使色谱柱填料上的C18链的空间状态恢复到正常水状态。柱前衍生氨基酸分析方法由于在衍生过程中的影响因素较多，如取样的准确性、衍生反应温度及时间、衍生剂的除去程度及样品的盐离子等都会影响其重复性，因此需要采用内标法来减少测量误差。采用内标法后，其重复性还是不错的，不比氨基酸分析仪法差。
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tiantaishan
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2013/5/27 10:24:57 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
新色谱柱使用前先用100%的乙腈0.5ml/min冲洗了2小时小时以上。然后用B冲洗了至少也是2小时。用A冲洗了一小时以上。内标主要的作用是校正衍生稀释后的体积，毕竟体积小，容易导致较大误差。如果氨水不行，那换磷酸盐或四级铵的碱（按反应原理来说，四级胺的碱应该是完全没有问题的，只是价格贵）来衍生有没有优势？？。

既然和氨基酸分析仪性能不差，为什么此方法都有20来年的历史，始终没有纳入国标检测？？（除了个别产品外，没有不普遍性，而且国外标准也是氨基酸分析仪为主）
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