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主题：【分享】总RNA分离纯化标准操作规程(SOP)

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发表于：2013/05/18 20:07:32 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

总RNA分离纯化标准操作规程(SOP)
3. 关键词：RNA 分离纯化
4. 目的：建立总RNA分离纯化的操作规程，以保证制备RNA的质量和效率。
5. 主体内容：
5.1主要仪器
研钵，恒温水浴，旋涡振荡器，冷冻台式高速离心机，
超低温冰箱，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。

5.2试剂
1．Trizol试剂（购自Invitrogen公司）
2．焦碳酸二乙酯(DEPC)
3．氯仿（新开封）
4．异丙醇（新开封）
5．无RNase灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（250℃ 3小时）装蒸馏水，然后加入0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。
6．75%乙醇：用DEPC处理后的水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于4℃冰箱。

5.3 相关器皿的预处理
1．塑料制品的处理
尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已经标明RNase-Free的塑料制品，如果没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下：
1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物质，活性很强，应在通风橱中小心使用。
2）将需要处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通分橱中室温处理过夜。
4）将DEPC水溶液小心倒入废液瓶中，用铝箔封住含有已用DEPC水处理过的塑料制品的容器，高温高压蒸汽灭菌至少30 min。
5）在烘箱中用合适的温度烘烤至干燥。置于干净处备用。
2．玻璃和金属制品
先用去离子水将器皿清洗干净，晾干，用铝箔包好，然后至烘箱中250℃烘烤3 小时以上。

5.4 操作步骤
第一部分匀浆
A 从组织中提取总RNA、
1）液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按照每50~100mg组织加入1ml Trizol，转入离心管进行下步操作。
2）匀浆：用电动匀浆器充分匀浆1~2min。注意，组织样品体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好。
B 从培养细胞中提取总RNA
1）粘壁培养细胞：不需蛋白酶消化，先将培养基去除，然后直接将Trizol加入到培养瓶中消化、裂解细胞，Trizol体积按10cm2/ml的比例加入。
2）悬浮培养细胞：直接离心收集细胞后用Trizol重悬、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106个动物、植物或酵母细胞，或1×107个细菌细胞。注意，在加入Trizol之前不能用其他缓冲液洗涤细胞，那样会增加mRNA降解的可能性。另外，在裂解酵母或细菌细胞时可以借助匀浆器。
第二部分相分离
1．匀浆组织加入Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注意：此时可以放入-70℃长期保存。
2．室温，12000 r/min，离心5 min。取上清于一新管。
3．按照1ml Trizol加入200μl氯仿，用手振荡混匀后室温放置2~3 min。注意：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
4．4℃，12000 r/min，离心15 min。小心吸取上层水相于一新管。注意：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱中，如只提取RNA，则弃下层酚相。
第三部分 RNA沉淀
5．按照1ml Trizol加入异丙醇0.5 ml，混匀，室温放置5~10 min。
6．4℃，12000 r/min，离心15min。弃上清，RNA沉淀管底。注意：RNA沉淀在离心之前是不可见的，常常在离心管的边缘或者底部形成凝胶状小球。
第四部分 RNA洗涤
7．按照1ml Trizol加入1ml 75%乙醇，震荡离心管，悬浮、洗涤沉淀。
8．4℃，8000 r/min，离心5 min。尽量去除上清。
9．室温晾干，或者真空干燥5~10 min。注意：RNA沉淀不要过于干燥，否则将会降低它的溶解度。
第五部分 RNA溶解
10．用50μl ddH2O，TE Buffer（pH7.5），或者0.5% SDS溶解RNA沉淀，然后于55~60℃温育5~10 min。注意：ddH2O，TE Buffer（pH7.5），或者0.5% SDS 均必须用DEPC处理并高压灭菌；另外，如果RNA后面要用于限制性内切酶分析，则不能用0.5% SDS 溶解。
第六部分 RNA质量检测
1）完整性：琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性。Trizol试剂可以很容易地分离所有种类的RNA。例如利用Trizol分离老鼠肝脏总RNA，琼脂糖凝胶电泳结果显示，在7~15kb处，高分子RNA（mRNA和 hnRNA）呈不连续的带状分布，在5kb（28S）和2kb（18S）有两条主要条带，而在0.2kb处则是小分子RNA（tRNA和5S）。
2）纯度分析：计算A260/A280的比率。利用Trizol试剂提取的RNA，其A260/A280比率为1.6~1.8，如果用TE溶解，则A260/A280大于1.8。
3）浓度和产量分析：测OD值，定量RNA浓度，计算产量。
附：每毫克或者1×106个培养细胞的总RNA预计产量

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2013/5/18 20:07:45 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

组织或细胞产量
肝脏 6~10μg
肾 3~4μg
骨骼肌或脑 1~1.5μg
胎盘 1~4μg
上皮细胞 8~15μg
纤维细胞 5~7μg

6 问题向导
1. RNA产量低
可能原因：
* 样品匀浆或者裂解不充分
* RNA沉淀溶解不完全

2. A260/A280比率小于1.6
可能原因：
* 用ddH2O代替TE溶解RNA沉淀，低离子强度和pH溶液增加A280的吸收值
* 用于裂解样品的Trizol试剂体积太小，或者匀浆后样品没有在常温下放置5min，造成裂解不完全
* 水相被酚相所污染
* RNA沉淀溶解不完全

3.RNA降解
可能原因：
* 从动植物中获得的组织没有及时处理或者冷冻，或者用于分离RNA的样品只是保存在-20℃，而不是-70℃
* 水溶液或者相关器皿没有经过RNase灭活处理
* 用于琼脂糖凝胶电泳的甲醛其pH值低于3.5

4.DNA污染
可能原因：
* 用于裂解样品的Trizol试剂体积太小
* 用于分离的样品含有有机溶剂（如乙醇）DMSO）、高浓度缓冲液或者碱性溶液

5.糖蛋白和多糖污染
解决办法：
* 在第5步沉淀RNA时，先加250μl异丙醇到水相，然后再加入250μl高盐沉淀剂（0.8M柠檬酸纳，1.2M NaCl）/ml Trizol裂解液，混匀后接第6步操作

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