6 问:多肽的分离制备, 如何上量?如何增大分离度?
答:反相HPLC应当是很好的分离小肽方法,用CH3CN或CH3OH:H2O(95:5)做流动相,看保留如何,若无保留,建议改用其他色谱方法进行分离。
关于多肽的分离,首先要知道它的分子量大小,然后选择不同类型的填料,如孔径的大小。我们先在分析柱(4.6MM内径)上做一下实验,找到最大的分离度,这一过程的难度是最大的,要不断地改变流动相和固定相,然后再线性或非线性放大到制备,放大的倍数按分析柱的实验结果。分离后可以通过冷冻干燥得到固体。
还可以考虑离子交换来分l离
7问: 做柱层析时(国产大孔吸附树脂),怎么才能把洗脱液中的树脂残留物处理干净?
答:大孔吸附树脂在上使用前,一般需要进行处理,方法包括用色谱纯的甲醇或乙睛洗到没有吸收;或树脂用乙醇浸泡2天,丙酮浸泡2天,然后用常规的酸,碱洗。再用丙酮回流二小时就可以用了。
8 问:由分析型
液相转为制备型
液相,其色谱系统需作多大调整?是否可以按照柱体积折算只改变流速?其上样量多大为宜?
答:(1)泵要换,流量要加大,压力可不变或减少;流通池要换体积更大的。
(2)整个系统的管路要更换更粗的,否则压力太大,而且特别容易发生堵塞。对流通池后的管路,最好增加反压调节器,否则管路太短的话,反压小会导致流通池气泡,管路长的话会导致峰展宽。
(3)检测器的响应时间和峰宽要设置合适,否则会导致收集时延迟体积的计算不准
(4)上样量主要根据柱子的大小、样品的浓度、制备是否根据分析条件放大(例如制备柱是否还用分析用填料);一般上样量与柱子直径的平方以及长度成正比。
9 问:流动相中含有盐时,收集液该如何除盐?选用挥发性酸,碱或盐(如醋酸铵)是否会在挥干溶剂或冻干过程中直接除去?
答:一般可以采用离子吸附的办法去掉(可以参考离子吸附有关技术)。但也是稍微麻烦的事情,最好,不加加酸碱盐,如果要加的话最好,要加挥发性的或者对产品或者检测没有干扰的。
可用G25脱盐,它是安马西亚出的一种葡聚糖凝胶。交联度大孔径小,对小分子的无机盐保留较大,而对分子量较大的有机物没有保留从而可以将盐份脱除。另外采用挥发性的酸,碱时,一般会在干燥过程中直接除去,但如果样品也有酸碱性,可能会与这些挥发性酸碱形成一定比例的盐。
10 问:制备型柱子柱压上升 柱效下降 怎么办?
答:对高价值的制备柱来讲,延长柱子寿命是很重要的。一般要注意保护柱子,一般来说,制备柱子一般需要保护柱配套。
下面是可能堵塞柱子的原因
(1) 如果您所分离的样品中杂质较多而您在上样前没有经过过滤(0.45微米),一些颗粒性杂质会积聚在柱头造成柱压升高,
(2) 也有可能是因为您所使用的流动向中含有缓冲盐的原因,结晶或发生化学变化而堵塞。可以把柱子冲一冲。
(3) 流动相是否符合
液相色谱的要求?是否过滤处理?
柱子再生处理办法如下:
(1)依次用水,甲醇,四氢呋喃,氯仿,甲醇来冲洗柱子,每种溶剂5-10个柱体积。
(2)如果效果不明显,将柱子按以上顺序反冲,一般将大大降低柱子效果,不到不要没有办法才采用。
(3)如果效果还是不好,就需要打开色谱柱,超声波清洗筛片(这样也会使柱子效果下降)。必要时挖掉色谱柱内受污染部位,填入新的填料,还可用3个月。(填的时候小心,别重新污染柱子)
11 问:制备柱柱跑干了影响柱效吗?
答:如果时间不长的话,可以用流动相多冲几个小时.柱效不一定变化很大.如果时间太久,柱效一定变低. 具体造成影响有多大,要靠柱效测定来确定,而不是干柱时间的长短。如果跑干了,对于PUMP的影响可能还大些,所以最好先把管路中的空气抽走再说。
一般说来,制备柱子跑干,属于操作失当。柱子闲置不用时,最好冲入甲醇或其他有机溶剂,一定要把两头堵住密封,这样保留的时间会较长。