主题：【分享】食品微生物快速检测方法

Limuhs—测试法用于革兰氏阴性菌脂多糖 的测定。这种方法可以在30分钟—1小时内定量测 定食品中存在的死去的和活着的革兰氏阴性菌的 细胞壁组成部分。这种测定法是使用剑尾蟹 (Limulus polyphemus)的变形细胞的溶菌产物来进 行的。剑尾蟹的血液被革兰氏阴性菌浸染时会发 生凝结，这是由于细菌的细胞壁组分(脂多糖)和变 形细胞之间出现丁胶凝作用，变形细胞是一种剑 尾蟹血液中特有的血细胞，它含有酶原和凝集酶， 当存在脂多糖时，酶原被激活，进一步与凝集酶反 应发生胶凝作用。内毒素的鉴别就是根据胶凝作 刚进行的，因为内毒素与革兰氏阴性菌含量呈线性关系，所以可以根据革兰氏 阴性菌的污染程度确定内毒素的含量。
    这个方法可用于食品中内毒素的快速检测，特别是新鲜易腐败的如牛奶、肉、鱼和蛋等食品，因为这些食品上的细菌多为革兰氏阴性菌。此方法还用于鉴定加工食品原料中革兰氏阴性菌（包括死菌在内）的含量，蛋白制品的卫生细菌学质量检测、肉类食品的细菌学质量检测，以及医学范围内的注射液质量检测等多个方面。
    ATP测定法是利用生物发光法，应用荧光素—荧光素酶制剂进行的，在活细胞中ATP含量近乎是恒定的，利用特殊的酶试剂水解掉细菌膜，使ATP释放，ATP与荧光素—荧光素酶制剂反应变成AMP和光，产生的光强度与ATP成正比，通过测定光强度可确定细菌浓度。这咱方法可用于鲜肉、鲜鱼、牛奶、啤酒、矿泉水以及无菌药品的检测等多种领域。
    ATP+荧光素+荧光素酶（Mg2+）→荧光素→荧光素酶→AmP+焦磷酸
    荧光素→荧光素酶→AMP（O）→氧化荧光素+荧光素酶+AMP+CO2+光
    直接表面荧光过滤技术，是将含菌产品制成过滤的食品均质液，经核孔一多聚碳化物膜过滤后，用吖啶橙染色效果不好，添加荧光增白剂天来宝（Tinopal），可以使模糊菌像变为可见，染色的菌发出的荧光从绿色、橙黄色到红色。检测时间为20-30分钟。
    总菌数/毫升=滤膜面积×计数菌落的算术平均值/视野面积×样品值
    氧气消耗测定法建立在密闭系统中连续极谱氧气测量的基础上，在密闭系统中微生物的低谢值越高，液体样品一培养基中氧气消耗越快。在25℃条件下的氧气测定室中，检测含菌数在104~107/ml的牛奶食品，大约1小时可以得出结果。
    食品微生物快速 检测法在加外发展非常迅速、普遍，而在国内应用较少。希望通过介绍这些较新的方法，能够对食品微生物工作者有所启示，对国内食品微生物检验方法结果对食品生产更有指导意义。

补充一下，供大家讨论。
1 分子生物学方法，direct-PCR, 滚环PCR，bio-PCR，nest-PCR, IC-PCR(免疫捕捉PCR)、IMS-PCR（免疫磁珠PCR），这些检测方法可在最多4个小时内，将致病菌检测到种，这些方法的特点是检测灵敏度很好，一般情况下检测体系中有100个细菌，就可以检测出来，另外无需DNA提取，直接在PCR之前，加一个94度的高温20分钟，让细菌裂解并释放DNA作为模板就可以了，但实验室必须有PCR条件，且操作技术相当熟练。
2 免疫学方法，ELISA检测方法，对于大规模的初步样品筛查，非常的适用，也是国外最常用的快速检测技术，但是遗憾的是由于食源性致病菌单克隆抗体的制约，我国没有自主生产的ELISA试剂盒，国外进口极其昂贵，96孔板检测试剂盒售价高达5000-6000元，检测成本实在是太高了，我目前无法普及，但是未来普及此检测技术，只是迟早的事情。该方法检测灵敏度在105-106cfu/ml，比分子方法低一点，但是检测通量很高。
3 分子+免疫学，就是用特异性抗体先富集确认，之后直接进行PCR扩增，比如IC-PCR(免疫捕捉PCR)、IMS-PCR（免疫磁珠PCR），这些方法并不流行，但是非常非常的实用，因为这些检测方法经过了免疫学识别和富集，PCR分子水平的检测确认，双重确认，检测结果非常准确。
总之，根据我们的经验，现有的方法都挺好，其实最关键的是如何在复杂的样品中富集到有效病原，病原拿到了，什么方法都能检测出来。另外，如果能免去预增菌过程，那么才叫真正的快速检测，要免除预增菌，膜过滤是一种最经济实用的方法，但是现在的滤膜用0.45um孔径，有点偏大，很多细菌比这个小，会漏检的。我们用0.22孔径滤膜，可以有效的将细菌富集起来去检测。

1 传统生物学方法，按照标准检测，最麻烦，最传统，但是最经典，可作为其他方法之验证。
2 显色培养基方法，用国外进口显色培养基检测，比较方便，目前最流行，使用简单，也不贵。
3 胶体金试纸条检测，购买国外进口试纸条，现场检测，这种方法10分钟可以检测到结果。但是检测灵敏度偏低。
4 ELISA，酶联免疫实验。目前只有国外进口，欧美四家大公司垄断了全球95%以上的市场，一个96孔试剂盒，售价高达5000-6000元，非常无奈，但是是国外最流行的快速筛选技术，检测灵敏度、检测周期都比较理想，不过国内现在有公司专业在做这方面的试剂盒了，估计价格很快会降下来，可能是将来主流的检测技术了，部分已经写进国标了。
5 IC-PCR，免疫捕捉PCR，用抗体特异性识别捕捉，之后再PCR扩增。最大的优势是，病原经过抗体识别、PCR检测双重检测，可一次鉴定到种，检测灵敏度可以达到十的两次方，不用核酸提取，所有反应在一个PCR管里进行，减少了病原的损失，缺点是检测时间大致在4个小时，是一张理想的验证手段。
6 Direct-PCR，增菌后直接PCR，比较简单的验证手段，增菌后直接扩增，受PCR检测体系的现实，灵敏度偏低，但是取决于样品中的菌含量。
7 Nested-PCR，两对引物巢式PCR。两对引物两次扩增，最大的优势是检测准确性、灵敏度可绝对保障，劣势是检测时间较长。
8膜过滤PCR，利用病原富集装置，富集之后检测，最笨的一种方法，但是是最实用的，病原经过微孔滤膜过滤后，可高效富集病原 ，之后去检测，大大提高检测灵敏度。
9 BIO-PCR，培养增菌后PCR扩增，这个技术只能做研究用了，就是分离培养后，用PCR检测，乏善可陈。
10 IMS-PCR，免疫磁珠PCR，用免疫磁珠捕捉，之后进行PCR，用磁珠富集样品中的病原，之后直接PCR扩增，非常实用的方法，主要是可以富集病原。
11 BAX快速检测系统，按照系统说明书操作。贵族实验室用的东西，灵敏度和其成本、假阳性一样出色。
12 RiboPrinter快速检测系统，按照系统说明书操作。同上，大同小异。

国标里用的血清学不是用来快筛，而是用来血清分型，是对生化鉴定结果从另一种检测原理上进行实验补充和确认。食品标准里面很少用快筛方法进行菌株确认，我见过的只有加拿大的Health Care、US FDA BAM肯定了一点点，药典里面倒是肯定了分子生物学方法。
免疫方法是否落伍我不敢说，但从国际上食品致病菌检测技术发展、实际应用效果来看，免疫学技术遇到了一个瓶颈：包容性、排他性性能越来越被新的技术超越（AFNOR认证实验总结中有详细的实验过程和结果）。免疫学的单抗较多抗是一大飞跃，排他性性能得到了极大提高，随之而来的是包容性的挑战。这是一个矛盾的2面，因为要找到目标菌的各菌株都带有的特异抗原太难了，也或者事实上大多数致病菌就不存在这样独一无二的抗原。从检测要求来看，包容性不足更影响检测方法可信度，所以免疫法产品就用多个单抗来弥补这个不足，虽然会带来一些排他性性能的降低（即产生部分假阳性结果）。从厂家角度来看，能做到进口高质量品牌产品持平的性能，同时做到国内可接受的价位，这就是成功之路。需要考虑的是这个市场能维持多长，毕竟新技术产品也在不断平民化（最近我比较关注3M公司的分子生物学产品，从资料上来看它应当是用了日本人发明的LAMP技术，仪器很便宜、很简单，就看它是否能克服LAMP原来的问题。国内华南理工也在开发这种技术）。

采用哪一种方法检测产品完全靠检验人员的技术水平。快筛产品在一些真的很有经验的老师眼里不上位，任何问题他们自己就搞掂了。可是到哪里去找那么多高水平的检验人员？检验的效率如何保障？好钢用在刀刃上，人员技术结合快检方法才能解决问题，用好快检方法才能解决问题，快检方法解放技术人员的大脑，让他们有时间来考虑疑难问题的解决方法。比如对于快检方法的阳性样品，如何通过简单地增加一些检验步骤快速地进行二次排查。

如何跨越式发展，广播里听得多了，可见到的不多。任何技术都要经过长时间的积累，PCR技术从发明到食品检测上的实用也有十几年，AOAC到2003年才承认了第一个PCR产品。前车之鉴总归会有一些意义，没有突破性的技术成功的机会难以把握。苹果公司的iPhone能从诺基亚手中夺过智能手机的宝座，不是跟从，而是革命。

食品标准里面很少用快筛方法进行菌株确认，血清学是为了分型，对标准及第一线检测不甚了解，血清学和酶联免疫技术，不是同一个概念，血清学就是最早的玻片凝集实验，而ELISA纯粹是一个检测手段，国标里面，早就有几个标准，同时将ELISA、pcr纳入标准里了，上海出入境检验检疫局参与制定的，伙伴网里面就能下载，你看一下就知道了，更不用说大量的行业标准里面的快速检测技术。艾滋病检测，就是用两种方法的检测，免疫学初筛，PCR、western确认，在未来的国标里面，还会有大量的快速检测技术出现，但是，没有一个能离开免疫学这一快速检测技术的金标准，这个所有做检测的人，都不会否认的。
准确到某个种，比如沙门，志贺，确实对抗体提出了挑战，但是就如你所说，快速检测，是一个初筛的技术，ELISA完全符合这个特点，食品检测中，怎么可能把没有在国标中，在国内普及的技术，完全放弃掉呢？
包容性，排他性，抑制用于对大型进口设备封闭型试剂的描述比较合适，用于抗体的描述好像不合适，也非专业词语。谢谢！免疫学技术出现几十年来，已经遍布各个检测领域，起码在未来的10年内，仍然是快速检测主流技术，要说有革命，那就是芯片了，但是蛋白芯片，仍然离不开抗体。