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主题：【分享】微生物保存——冷冻真空干燥保存法

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发表于：2014/01/14 17:14:16 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1、原理

冷冻干燥保藏菌种法可克服简单保藏方法的不足。利用有利于菌种保藏的—切因素，使微生物始终处于低温、干燥、缺氧的条件下，因而它是迄今为止最有效的菌种保藏法之一。保藏菌种范围广、时间长、存活率高。

主要步骤为：①将待保藏菌种的细胞或孢子悬液悬浮于保护剂（如脱脂牛奶）中；②在低温（-45℃左右）下使微生物细胞快速冷冻；③在真空条件下使冰升华，以除去大部分的水。

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2014/1/14 17:14:40 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

2、材料

菌株

待保藏的各种菌种。

试剂

2% HCl；脱脂牛奶（20%乳液）、50%甘油。

器具

培养皿、5mlEP管、接种环、大三角瓶、高压蒸汽灭菌锅、牛皮纸、酒精灯、恒温培养箱、振荡培养箱、离心机、酒精棉球、安瓿管、标签、移液枪、普通棉、、冻干机。

培养基：LB液体培养基、LB固体平板培养基。

3、主要流程

备安瓿管→备脱脂乳→制菌悬液→分装→预冻→真空干燥→封管保藏

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2014/1/14 17:15:11 Last edit by 012304

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2014/1/14 17:15:37 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

4、操作方法

4.1准备安瓿管

安瓿管先用2%HCl浸泡过夜，再用水洗多次，用蒸馏水冲洗三次，烘干。管口塞上棉花，用牛皮纸包扎，灭菌备用。（121℃灭菌30min）

4.2制备脱脂乳

使用脱脂奶粉配兑脱脂牛奶，配成20%乳液，灭菌（112℃灭菌5min），并做无菌试验后备用。

4.3制菌悬液

①平板划线：将活化后的菌株用接种环进行平板划线，对菌种进行纯化。倒置37℃恒温培养过夜。

②增菌培养：挑取单个菌落接种于液体培养基（3ml左右）中，振荡培养。

③甘油保存：菌液：甘油=0.75:0.75ml的比例，对菌株进行甘油保存（2管）。

④离心：将EP管放入离心机中进行离心，去掉培养基。

⑤配菌悬液：将1ml无菌脱脂牛奶直接加到离心后的EP管内，轻轻搅乱使其均匀地悬浮在牛奶内成悬浮液。一般要求制成的菌液浓度达108~1010个为宜。

4.4分装

用移液枪将悬浮液分装入安瓿管底部，每支安瓿管的装量约为0.2毫升(需4管) 塞上棉花，并贴上标签。

4.5预冻

将分装好的安瓿管在冰箱冷冻室进行预冻。

4.6真空干燥

预冻以后，将安瓿管放入真空器中，开动真空泵进行干燥。（冻干机的使用方法）

4.7封管

封管前将安瓿管装入歧管；真空度抽至1.33Pa（0.01毫米汞拄）后，再用火焰熔封，封好后，要用高频火花器检查各安瓿管的真空情况。如果管内呈现灰蓝色光，证明保持着真空。检查时高频电火花器应射向安瓿管的上半部。

采用酒精喷灯，封管。

4.8保藏

做好的安瓿管应放置在低温避光处保藏。（4℃冰箱保藏）

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2014/1/14 17:15:57 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

5 注意事项

（1）安瓿瓶不易进水，清洗时拿少量安瓿瓶慢慢倾斜，使其管内浸入盐酸；用蒸馏水洗时亦如此；塞棉花时注意松紧适宜。

（2）脱脂乳最好在使用头一天配制好灭菌；灭菌需注意温度不能过高，在112℃灭菌10分钟即可；当压力降为0后，应尽快将其拿出，防止高温破坏其营养成分（灭菌后颜色发生变化的不可用）。

（3）对菌液进行离心前，因质量不等，需对管进行称重，用水进行配平。

（4）离心后倒培养基需十分注意，防止将沉淀的细菌倒掉。

（5）倒入脱脂牛奶后，需要枪头将菌悬液混匀。

（6）分装时，需至少三个人配合，一个吸菌液，另一个塞棉花，还有一个贴标签。

（7）采用酒精喷灯进行封管时，烧的温度要适宜。

1株细菌：2管甘油保存（1.5ml50%甘油），4管安瓿瓶保存（1ml脱脂牛奶）即需要：1/4平板，1个5mlEP管，3mlLB培养基，2个1.5mlEP管，4个安瓿瓶，1.5ml50%甘油，1ml脱脂牛奶，4个标签

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