主题：【分享】《CNW液相色谱柱使用征文大赛之四》：CNW Athena C18液相色谱柱检测婴幼儿乳粉中5种核苷酸

婴幼儿乳粉中核苷酸的测定

实验目的：婴幼儿乳粉中核苷酸的测定

实验方法：

1.原理

试样经过水提取，用沉淀剂沉淀蛋白质后，通过高效液相色谱分离，用紫外检测器外标法测定试样中核苷酸的含量。

2.试剂和材料

2.1四丁基硫酸氢铵

2.2甲醇

2.3磷酸氢二钾溶液，浓度为0.1 mol/L：

称取K2HPO4 2.28g，用超纯水溶解并定容到100mL。

2.4磷酸二氢钾溶液，浓度为0.1 mol/L：

称取KH2PO4 13.60g，用超纯水溶解并定容到1000mL，用0.1mol/LK2HPO4调pH至5.0。

2.5醋酸溶液，浓度为100 mL/L： 取10 mL醋酸，加水定容到100 mL。

2.6磷酸盐缓冲液，含1.40 mmol/L 四丁基硫酸氢铵的0.01 mol/L KH2PO4缓冲液：

取100 mL 0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液，加0.4753 g 四丁基硫酸氢铵，用0.1mol/LK2HPO4调 pH 至3.3，加超纯水定容到1000 mL。

2.7核苷酸标准混合液（必须当天配置）：

分别称取核苷酸标准品CMP20mg、AMP20mg、UMP20mg 、GMP10mg和IMP10mg（准确至0.1mg），用超纯水溶解定容至100mL。此标准溶液浓度为：CMP200μg/mL、AMP200μg/mL、UMP200μg/mL、GMP100μg/mL、IMP 100μg/mL。

3 仪器和设备

3.1 分析天平：感量0.0001g

3.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器。

3.2超声波振荡器

4 分析步骤

4.1试样处理

称取混合均匀的试样约5g，精确到1mg，于100mL三角瓶中，加入20mL热水（50-60℃）充分溶解试样，超声波振荡器振荡5min。将试样溶液移入50mL容量瓶中，加入5mL醋酸溶液，定容，滤纸过滤，所得溶液经0.45μm微膜过滤备用。

4.2测定

4.2.1参考色谱条件：

流动相：磷酸盐缓冲液：甲醇＝1000：40

色谱柱： Athena C18，120A（250×4.6mm，5μm）色谱柱

流速：1 mL/min

波长：254 nm

柱温：25℃

进样体积：20μL

4.2.2标准曲线绘制：

分别吸取标准混合溶液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL，加超纯水定容至100mL ，配成核苷酸系列标准工作液。



结果分析：

1.最低点标准对照品图谱



2.乳粉测定图谱



3.标准曲线线性

Cmp



Amp



Ump



Gmp



Imp





讨论：

在核苷酸的测定中一直困扰我们的就是色谱柱的选择，刚开始尝试了几种色谱柱都不能把五种成分完全分离，后面在安谱工程师的推荐下用了Athena C18色谱柱，分离效果不错，因此我们就选用了Athena C18色谱柱。