主题：【分享】《CNW液相色谱柱使用征文大赛之九》：CNW Athena C18-WP液相色谱柱测定泥蚶中的苯并（a）芘含量

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发表于：2014/07/30 10:31:35 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

CNW Athena C18-WP液相色谱柱测定泥蚶中的苯并（a）芘含量

多环芳烃（PAHs）是一类广泛存在于环境中的持久性有机污染物，主要源于有机物的热解和石油、媒等化石燃料的燃烧，通过地面径流、污水排放以及大气颗粒沉降进入海洋环境^[1]。苯并[a]芘（Benzo[a]pyrene，B[a]P）为目前已知的具有致癌作用的20多种多环芳烃之一，占环境中所有多环环芳烃的1%～20%^[2]。目前国内外研究测定B[a]P含量的方法较多，主要包括高效液相色谱—荧光检测器法^[3-5]，气相色谱—质谱法^[6-8]，气相色谱—高分辨质谱法^[9]，紫外分光光度法^[10]。

双壳贝类与其他海洋生物相比，具有分布广、富集能力强、迁移能力弱、采样和检测较方便等优点，更重要的是其体内有机污染物水平能够较准确地反应出海水环境中的污染水平，因此海洋贝类已广泛地应用于海洋环境中有机污染物的检测^[11]。本研究以沿海滩涂习见贝类泥蚶作为研究对象，通过正己烷提取、二氯甲烷浓缩、固相萃取柱净化的方法进行B[a]P检测的前处理，结合高效液相色谱—荧光检测器对泥蚶B[a]P残留实现了准确度高、方法快捷有效的检测，并就不同浓度B[a]P对泥蚶染毒第15天的不同组织的B[a]P富集浓度值进行了检测，以期为完善泥蚶等海水双壳贝类有机污染物质量安全检测工作提供实验方法

1实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪（带荧光检测器）：Varian prostar 210型；氮吹仪：EYELA MG-2200；

漩涡混合器：QT-1上海琪特分析仪器有限公司；CNW 12位固相萃取真空装置；超声波清洗器：宁波新芝生物科技股份有限公司，SB-5200DT；离心机：Eppendorf centrifuge 5810R；电子天平：Satorious CPA225D, BT25S；BAP苯并（a）芘专用SPE小柱（CNW公司）：500mg/6mL；亲脂PTFE针式滤器。

乙腈（色谱纯），正己烷（色谱纯），二氯甲烷（色谱纯）；苯并（a）芘标准品（纯度≥97%，Dr）；水：超纯水（符合实验室一级用水标准）。

1.2样品处理

1.2.1试样提取

称取5g均质(精确至0.01g)试样于50mL离心管A，加入10mL正己烷，涡旋振荡10s后，放入40℃超声水浴30min；以4500 r/min离心5 min，吸取上清液于30 mL玻璃离心管B中，再加入10mL正己烷重复提取操作一次。合并两次上清液，待净化。

1.2.2试样净化

依次用5mL二氯甲烷，5mL正己烷活化BAP苯并（a）芘专用SPE小柱，将待净化上样到小柱上，然后再用2mL正己烷润洗样品瓶，然后也上样到柱上，用6mL正己烷淋洗小柱，再用6mL二氯甲烷收集洗脱液于5mL玻璃离心管中，将收集液在40℃下氮气吹干，用1mL乙腈定容，超声1min，再漩涡混合10s，过0.22um亲脂PTFE针式滤器，待上机检测。

1.2.3测定

取试样溶液15uL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，从标准曲线上查得样品中苯并（a）芘的浓度。

1.3色谱条件

色谱柱：CNW Athena C18-WP柱，250mm×4.6mm，5um；

流动相：乙腈：水（95:5，v/v）；

流速：1.0mL/min；

荧光检测器：激发波长384nm,发射波长406nm；

柱温：35℃；

进样量：25uL。

1.4标准溶液的配制

准确称取苯并（a）芘10mg，置于100ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，该贮备液浓度为100ug/ml，于冰箱中3℃～5℃保存。准确吸取1ml的标准贮备液，置于100ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，该使用液浓度为1.0ug/ml。分别准确吸取0.1ml，0.5ml，1.0ml，2.0ml，5.0ml标准储备液，置于10ml容量瓶中，制成浓度为0.01ug/ml，0.05ug/ml，0.1ug/ml，0.2ug/ml，0.5ug/ml的标准工作液。

1.5结果计算

苯并（a）芘含量的计算公式为：

X（ug/kg）= C·V·1000/m

其中：X—样品的苯并（a）芘含量，ug/kg；C—从标准工作曲线中得到的待测液中苯并（a）芘的浓度，ug/mL；V—待测液体积，mL；m—试样质量，g。

2结果与分析

2.1标准曲线线性范围

在上述色谱条件下，将浓度为0.01ug/ml，0.05ug/ml，0.1ug/ml，0.2ug/ml，0.5ug/ml，1.0ug/ml的标准工作液依次从低浓度到高浓度进样，以所得峰面积对相应的标准溶液浓度（ug/ml）作标准曲线(标样谱图见图1)，并计算标准曲线的回归方程及相关系数。实验测得苯并（a）芘标准溶液浓度（ug/ml）在0.01～1.0范围内，其线形回归方程为Y=1506700x+11664；相关系数0.9992，结果表明线性良好，见图2。

图1 苯并（a）芘标准物质的色谱出峰图

Fig1. Chromatograms of standard solution for benzo(a)pyrene

图2苯并（a）芘含量的标准工作曲线图

Fig 2. Standard calibration curve of benzo(a)pyrene concentration

2.2精密度试验和重复性

取配制好的苯并（a）芘标准溶液，连续进样6针，计算苯并（a）芘保留时间的重复性，相对标准偏差为0.17%；计算苯并（a）芘面积的精密度，相对标准偏差为1.21%，均符合相关要求（见表1）。表明本方法的精密度良好。

表1. 精密度和重复性测试结果

Tab 1. Accuracy and repeatability of result

2.3回收率试验

为考察方法的准确度，以不含苯并（a）芘的空白泥蚶为样品，进行苯并（a）芘的添加试验。设计0.01ug/ml，0.025ug/ml，0.04ug/ml三个添加浓度，按“1.2”项操作，每个浓度作6平行，测定结果见表2。试验结果表明，样品加标回收率为78.75%～97%，RSD范围4.8%～8.8%。

表2 苯并（a）芘回收率试验结果

Tab 2. Recovery of benzo(a)pyrene

2.4不同浓度对泥蚶染毒试验不同组织B[a]P残留含量检测结果

采用本方法就不同浓度（0.5ug/L和10ug/L）苯并（a）芘对代表性滩涂贝类泥蚶（Tegillarca granosa）染毒实验第15天的不同组织（足、消化盲囊、鳃丝、闭壳肌）苯并（a）芘富集浓度的检测结果如表3所示。在泥蚶的鳃丝和消化盲囊B[a]P含量要高于闭壳肌和足部，并且在10ug/L 的苯并（a）芘染毒条件下，鳃丝和消化盲囊富集能力分别为闭壳肌和足部的5和10倍，苯并（a）芘在消化盲囊的富集能力比鳃丝强，这与肖国强等^[11]研究在10ug/l浓度下苯并（a）芘胁迫泥蚶（Tegillarca granosa）消化盲囊和鳃丝基异吩乙氧基异吩唑脱乙基酶(EROD)、谷胱甘肽转移酶(GST)活力和脂质过氧化物(MDA)含量和活性表现出一定的剂量效应关系具有相关性。

表3 不同浓度苯并（a）芘泥蚶染毒第15天不同组织苯并（a）芘含量的检测结果

Tab 3. Concentration of B[a]P on different tissues in Tegillarca granosa on 15 days’ exposure to different concentration of B[a]P

3讨论

3.1 本方法操作步骤简单，回收率稳定，能准确地测定泥蚶中的苯并（a）芘含量，将有效提升各级检测机构分析水产品中苯并（a）芘含量的工作效率。为保证检测效果，操作过程还应注意以下几点要求：（1）在BAP苯并（a）芘专用SPE小柱固相萃取柱的活化和洗脱目标物过程中，都要求保持自然滴定流速，并保持SPE小柱湿润状态。（2）氮气吹干过程中，避免气流过大造成液体溅出，并要求使玻璃离心管溶剂不完全吹干，以此减少损失。

3.2水产品的苯并（a）芘存在于脂肪和肌肉组织中，正己烷具有较好的提取效果^[12]。本方法通过对泥蚶不同组织样品进行正己烷提取，再经固相萃取柱净化，有效排除了杂峰对目标峰的干扰，得到的色谱图背景干净，色谱峰形好，达到了较理想的净化效果（见图2和图3），净化效果优于田晓玲等^[13]的液液萃取法和吴敏等^[12]研究的C₁₈SPE小柱和Florisil SPE小柱。同时，过固相萃取柱后的试样净化较完全也有利于延长色谱柱的使用寿命。

3.3 本方法的创新点为利用二氯甲烷对被滞留在BAP苯并（a）芘专用SPE小柱内的苯并（a）芘进行洗脱，而且整个样品提取与净化过程有机溶剂使用量少，达到了减少环境污染和简化操作步骤的目的。

3.4在苯并（a）芘的色谱条件下（乙腈+水=95+5），用CNW Athena C18-WP柱分析时，具有柱压低，Varian prostar 210型高效液相显示柱压为725psi。并且，本人发现在应用不同色谱条件下，用CNW Athena C18-WP柱分析与检测，其柱压普遍低于2000psi。