主题：【第七届原创】细菌的实验室检测方法进展——金黄色葡萄球菌的鉴定方法

由于目前全球化的发展，世界各地区之间的人流物流日益广泛和频繁，病原菌也会随着这种流动而迅速扩散，并且不像以前要由邻接地区由近而远的扩散，而是直接跨越地区、造成国家之间乃至洲之间的迅速扩散。因此，将先进的技术和检测方法应用于我们的实际工作，可准确的检测和有效预防因金黄色葡萄球菌引起的食物中毒及各类感染性疾病。现就其检测方法做一总结。
1 传统常规培养检测方法
1.1        直接涂片镜检
    取标本涂片，革兰氏染色后镜检，可见球形、单个、成对和葡萄串状排列，革兰氏染色阳性，无芽胞，无荚膜。根据细菌形态、排列和染色性可作出初步诊断。
1.2        分离培养与鉴定
将标本接种于血琼脂平板，经37℃培养24h后形成圆形、光滑、大而凸起、湿润、不透明的菌落，菌落呈金黄色或者白色，有透明溶血环。接种甘露醇培养基经37℃培养24h后，形成淡橙黄色菌落。在Baerd-Parker平板中经37℃培养24h后，菌落为圆形、光滑突起、湿润，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一浑浊带，在其外层有一透明圈。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在7.5%氯化钠肉汤中生长，因此利用它的这个特性进行污染标本的分离。在纯培养分离好的平板上挑取菌落配置菌悬液，在VITEK2微生物鉴定系统用GP卡鉴定。



金黄色葡萄球菌在血平板上的形态



金黄色葡萄球菌在高盐甘露醇平板上的形态



金黄色葡萄球菌在Baerd-Parker 平板上的形态



金黄色葡萄球菌光镜照片（1000倍）

1.3        血浆凝固酶试验 
吸取0.5ml 兔血浆与0.5ml金黄色葡萄球菌试液浸液肉汤24h 培养物充分混匀，置36±1℃培养，每隔30min 观察一次，连续观察6h，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。
1.4        耐热核酸酶试验
  将24h 肉汤培养物沸水浴处理15min，用接种环划线刺种于甲苯胺兰-DNA 平板，（36±1）°C 培养24h，在刺种线周围出现淡粉色者为阳性。本试验金黄色葡萄球菌为阳性。
    金黄色葡萄球菌的传统实验室检测方法经典、可靠，仍是实验室一直沿用的检测方法。但操作复杂，所需事间长，尤其在突发公共卫生事件需要进行流行病学调查和溯源时，很难满足准确、快速溯源的需要。
2 对金黄色葡萄球菌肠毒素的检测方法
2.1从分离菌株培养物中提取葡萄球菌肠毒素
待测菌株接种营养琼脂斜面，37℃培养24h，用5ml生理盐水洗下菌落，倾入60ml产毒培养基中，每个菌种种一瓶，37℃震荡培养48h，震速为100次/min，吸出菌液，100℃加热10min，8000r/min离心20min，取上清液100ul进行试验。
2.2从食品中提取葡萄球菌肠毒素
牛奶盒奶粉经过前处理形成脱脂牛奶用蒸馏水进行稀释（1:20）取100ul稀释后的样液进行试验；脂肪含量不超过40%的食品，经前处理移去脂肪，取上清液进行过滤除菌。取100ul的滤出液进行试验；脂肪含量超过40%的食品经前处理，将下部水相层进行过滤除菌，取100 ul的滤出液进行试验。其他食品可酌情参考上述食品进行处理。
2.3葡萄球菌肠毒素的检测
将所有数量的微孔条插入框架中，将样品液加入微孔条的A-G孔，每孔100ul。H孔加100ul的阳性对照，用手轻拍微孔板充分混匀，用黏胶纸封住微孔以防溶液挥发，置室温下孵育1h。将孔中液体倾倒至含10%次氯酸钠溶液的容器中，确保孔内不残留液体，每孔加入250ul的洗液，如此反复操作4次。每孔加入100ul的酶标抗体，置室温下孵育1h。重复上述洗板步骤，加入50ul的TMB底物和50ul的发色剂至每孔中，室温黑暗避光处孵育30min。加入100ul的2mol/L硫酸终止液，30min内用酶标仪在450nm波长条件下测量每个微孔溶液的OD值。OD值小于临界值的样品孔为阴性，表述为样品中未检出某型金黄色葡萄球菌肠毒素；OD值大于或等于临界值的样品孔为阳性，表述为样品中检出某型金黄色葡萄球菌肠毒素。
3 用脉冲场凝胶电泳对金黄色葡萄球菌分型和检测的方法
      金黄色葡萄球菌DNA经限制性内切核酸酶（SmaI）消化后，可获得5-20条片段（10-700kb），根据电泳条带的不同形式对其分型。脉冲场凝胶电泳分型在辨别能力、分型和重复性方面具有其他分型所不具有的优势，所以被认定为金黄色葡萄球菌分型的“金标准”。他已经被广泛用于金黄色葡萄球菌的医院感染和甲氧西林抗性的流行病学调查。金黄色葡萄球菌的脉冲场凝胶电泳操作步骤可参照PulseNet公布的金黄色葡萄球菌的标准化程序。



MRSA的脉冲场凝胶电泳图谱
4  聚合酶链式反应（PCR）
聚合酶链式反应(PCR)技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法。PCR 反应程序为:94 ℃变性5min，再30次循环即94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min ，72 ℃延伸10 min。PCR 产物1.5%琼脂糖凝胶电泳。电泳后在凝胶成像系统中成像。PCR 技术由于其高度的特异性、敏感性、快速易操作性，在临床诊断、流行病学调查、食物中毒事件中金黄色葡萄球菌的检测诊断和分型中正发挥着巨大的作用。

结论：传统常规培养检测方法是实验室鉴定金黄色葡萄球菌的“金标准”，脉冲场凝胶电泳为金黄色葡萄球菌分型的“金标准”，聚合酶链式反应（PCR）为快速检测方法，可应用于食物中毒等突发事件的处理中。但金黄色葡萄球菌需要和表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、其他凝固酶阳性的葡萄球菌进行鉴别。总之，无论运用何种检测技术，检测金黄色葡萄球菌都离不开快速、准确和有效这些原则。应用先进的技术和检测方法用于我们的实际工作，以准确的检测和有效预防因金黄色葡萄球菌引起的食物中毒及各类感染性疾病。

参考文献
[1] 王秀茹.预防医学微生物学及检验技术[M].北京：人民卫生出版社，2002：754-757.
[2] 高涛.食品中金黄色葡萄球菌肠毒素及检测方法的研究进展[J].福建分析测试，2003，12（2）.
[3] 邓志爱，李孝权，等.食源性金黄色葡萄球菌致病分离株RAPD 分子分型研究[J].中国卫生检验杂志，2006，16（5）：619-620.
[4] 王会娟，王丽，等.实验室常用的微生物快速检验技术[J].肉类工业，2004（9）：40-42.
[5] GB4789.10-2010《食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》.
[6] 刘佳妍，金莉莉，王秋雨.细菌基因组重复序列PCR 技术及其应用[J].微生物学杂志，2006，26（3）：90-93.
[7] 王赞信，张俊彦.一起食物中毒金黄色葡萄球菌肠毒素基因的检测[J].中国卫生检验杂志，2006，16（6）：665-666.

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