主题：【原创】诊断芯片制备过程的SOP二

4. PCR标记探针
吸取5 µl步骤3中制备的PCR产物于0.2 ml 薄壁管管中，并加入PCR-mixtureⅡ试剂,成分如下：

          ddH2O                                         30µl
10 Buffer                                       5 µl
10 mmol/L dATP-dGTP-dCTP mixture              1 µl
1 mmol/L dUTP                                1 µl
10 µmol/L HCV primer mixture
                  HBV primer mixture
                  812 primer mixture
                  413 primer mixture                      各 1 µl
          413PCR产物                                  1 ul 
          尿嘧啶糖基化酶                                0.5U
          再加入标记试剂:
        0.1 mmol/L Cy5-dUTP                             1µl           
        Taq酶                                          0.5 µl
      用手指弹eppendorf管底部10下，混匀样品。
1)    将薄壁管置于MJ Research PTC-225 PCR仪中按下列程序进行PCR反应：
          ①95℃    1.5 min
          ②95℃    30 sec       
          ③58℃    30 sec       
          ④72℃    30sec     
          ⑤Goto② for 35 cycles       
          ⑥72℃    5 min       
          ⑦4℃    forever（待机）       
          ⑧END
2)    取出薄壁管，-20℃蔽光保存。
4. 杂交
1)    将3中制备的探针于真空抽干机中抽干，加入6.6µl预热的杂交试剂Ⅰ溶液，在避光条件下充分振荡溶解探针，再加入6.6ul杂交试剂Ⅱ,混匀后于5000 rpm离心10 sec。
2)    将溶解的探针和待杂交的玻片置于95℃的水浴锅内变性2min。       
3)    将变性好的探针避光冰浴, 将变性好的玻片插入到盛有无水乙醇的染色缸内室温放置30 sec，取出, 置于95℃水浴锅外罩上烤干。
4)    取13 µl的上述探针，滴于玻片上，用镊子上端将1818mm 盖玻片盖于其上，玻片置于专用玻片盒中，封上PARAFILM。
5)    将玻片盒置于6层纱布的湿润的饭盒内，将饭盒置于Robbins Model 1000杂交炉内，42℃杂交，3 hr。
6)    立即放入盛有2 SSC+0.2% SDS溶液的烧杯中，使盖玻片自然脱落。
7)    准备两个染色缸和一个500ml烧杯(内置玻片架)，分别装有1SSC+0.2%SDS，1SSC+0.2%Tween-20，0.1 SSC,两个染色缸放入60℃水浴锅中。烧杯置于磁力搅拌器上.
8)    将玻片依次浸入以上三个染色缸中洗涤10 min,在烧杯中搅拌洗涤10分钟.
9)    避光晾干后扫描。
注：Cy5对光敏感，因此操作时尽量避光。         
5. 结果分析
    将诊断芯片插入ScanArray 3000扫描仪中进行扫描，并使用Imagene软件分析杂交结果。扫描结果显示检测监控系统中阳性对照有荧光信号; 阴性对照没有荧光信号，再在疾病诊断系统中根据信号的有无来判断待测样品是阴性还是阳性。

诊断芯片试剂配制的SOP
一、主要试剂的配置
1.    诊断芯片核酸抽提液配方
    异硫氰酸胍                       92.6 g
    柠檬酸钠(B46)                        13 ml
    超纯水                        26 ml
    十二烷基肌氨酸钠(B17)              13 ml
    β-巯基乙醇(B10)                    1.3 ml
    饱和酚                        130 ml
    tRNA (库存半成品)              8.5 ml
      注：4℃保存；单管分装 500 µl RNA提取液＋500 µl氯仿:异戊醇(49:1)；DNA病毒抽提液中饱和酚换为平衡酚。
1)    tRNA配制：tRNA 1 mg +超纯水 2 ml
注：待检及分装 4℃；长期贮存 -20℃
2)    饱和酚的制备
A.    从冰箱中取出-20℃保存的重蒸酚，待温度恢复至室温后，用68℃水浴融化
B.    称取0.1 g一羟基喹啉于250 ml试剂瓶中，依次加入100 ml重蒸酚，50 ml超纯水，溶解混匀，4℃静置过夜
C.    第二天用滴管把水分吸出
注：在有水相覆盖时，避光4℃可保存一个月
3)    B17配制：称取十二烷酰肌氨酸钠25 g，加入超纯水定容至体积为500 ml，4℃保存
4)    B46配制：称取柠檬酸钠36.75 g，加入超纯水定容至体积为500 ml
  注：先测pH至7.0，后定容；高压灭菌；室温贮存，首次开启使用后4℃贮存；用HCl溶液（HCl:水=1:11）调pH
5)    B47配制：称取醋酸钠136.08 g，加入超纯水100 ml及冰乙酸250 ml溶解,用冰乙酸调节溶液pH至4.0，再用超纯水定容至体积为500 ml，高压灭菌后室温保存，首次开启使用后4℃贮存
2.    TE缓冲液：在800 ml蒸馏水中加入10 ml 1mol/L的Tris－HCl（pH 8.0）和0.2 ml 0.5 mol/L 的EDTA（pH 8.0），加蒸馏水定容至1000 ml。
3.    75％乙醇：量取95％乙醇37.5 ml，加入10 ml蒸馏水，充分混匀，4℃保存。
4.    20×SSC溶液：称取NaCl 175.3 g，柠檬酸三钠88.2 g，加入800 ml蒸馏水，用10 mol/L 的NaOH调pH至7.0，加蒸馏水定容至1000ml。
5.    PBS溶液：800 ml蒸馏水中溶解8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4，用HCl调节溶液的pH值至7.4，加蒸馏水定容至1000 ml。在1.034×105Pa高压下蒸汽灭菌20分钟，保存于室温。
6.    10％十二烷基磺酸钠溶液（SDS）：在800 ml蒸馏水中溶解100 g电泳级SDS，加热至68℃，用浓盐酸调节pH值至7.2，加水定容至1000 ml。
7.    琥珀酸酐溶液：称取1 g琥珀酸酐溶解于100 ml/L的硼酸溶液和100 ml 1－甲基－2－吡咯烷酮中。
8.    24:1氯仿：异戊醇（V/V）：量取240 ml氯仿，加入10 ml异戊醇，充分混匀。
9.    25:24:1饱和酚:氯仿:异戊醇（V/V/V）：将重蒸酚于                      50℃水浴锅中融化，加入等体积的0.2 mol/L Tris，充分混匀，加等体积的氯仿：异戊醇（24:1），混匀。
10.    酸性酚:氯仿:异戊醇：将重蒸酚于50℃水浴锅中融化，加入等体积的蒸馏水充分混匀，再加等体积的氯仿:异戊醇（24:1），混匀，此时pH值约为4.5。
11.    点样液（spot solution）：Sigma公司购得。
12.    杂交液：Ⅰ:6×SSPE+3×SSC+10×Dehart,  Ⅱ:  Frmamide                    各100 µl
13.    反转录试剂：
HCV反转录引物(10 mmol/L)              0.5µl
植物基因反转录引物                       0.5 µl
超纯水                                  6 µl

0.1 mmol/L DTT                          1 µl
5×first stand buffer                        2 µl
10 mmol/LdATP-dGTP-dCTP-dTTP Mixture  0.25 µl
14.    反转录酶：SuperScriptII反转录酶(5U/µl)                     0.2µl
15.    PCR-mixtureⅠ:
    ddH2O                                        31.5 µl
10×Buffer                                        5  ul
10mmol/L dNTP                                    1ul
  10mmol/L HCV primer                              1ul
10mmol/L 821引物                                    1ul
  Taq酶                                            0.5ul
                                             
16.    PCR-mixtureⅡ
  10×buffer(含25mmol/L MgCl2 )          5 µl
10 mmol/LdATP－dGTP－dCTP  Mixture  1 µl
  1 mmol/L dUTP                        1 µl
  15 mmol/L HBV  primer  Mixture           2 µl
  15 mmol/L HCV  primer  Mixture           3 µl
  植物基因primer mixture                           1 µl
尿嘧啶糖基化酶                                0.5U
标记试剂:  0.1 mmol/LCy5－dUTP                  1 µl
标记酶 :      Taq酶（5 U/µl）                      0.5 µl
17.    10×洗涤浓缩液：10×SSC+2%SDS ,10×SSC+2%Tween-20,10×SSC                        各5 ml