主题：【原创】诊断芯片制备过程的SOP一

诊断芯片制备过程的SOP
1. 靶基因DNA的制备
  在分别装有HBV、HCV及植物基因片段的质粒的0.5 ml eppendorf 管中加入100 µl双蒸水，将质粒稀释至4~6 ng/µl，作为PCR扩增模板。在50 µl PCR扩增体系中掺入上述模板1~2 µl，每种模板做10管，共9种模板，分别包括HBV、HCV及植物基因的片段各3个，每管为50µl体系。
    在0.5 ml eppendorf 管中依次加入下列试剂，组成50µl PCR扩增体系：
ddH2O                            41 µl
10  buffer                          5 µl
10mmol/L dNTP                      1 µl
10mmol/L primer                      1 µl
template（HBV、HCV及植物基因）    1 µl
Taq 酶                            0.5 µl
    混合后，将eppendorf管置于MJ Research PTC-225 PCR仪中按下列程序进行PCR反应：
          ①95℃        90 sec
          ②95℃        30 sec
          ③58℃        30 sec
          ④72℃        30 sec
          ⑤goto② for 35 cycles
          ⑥72℃      300 sec
          ⑦4℃    forever（待机）       
          ⑧END
    将PCR产物（10管）合并，经电泳确定条带的专一性，达到专一条带方可用于点样，同时测OD值，OD260/OD280≥1.8。
    PCR产物中加入1/10体积的醋酸钠溶液（浓度为3 mol/L，pH 5.2）及等体积的异丙醇，于-20℃沉淀2 hr后室温干燥。
2. 点样
    用双蒸水将上述各靶基因的终浓度调至500 ng/µl，使每个点的点样量达到500 ng，并将384孔板放入Cartesian点样仪内，按设计要求编写点样程序(如下图)，再放入表面特殊处理的玻片，启动点样程序（nxl-1），将靶基因的PCR产物点于玻片上，经过0.5 hr水合，再自然干燥，放在4℃保存。

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821阳    HBV1    HBV5    HBV6    1SPOT    HCV1    HCV4    HCV5    821阴    413阳

3. 芯片的质量标准
    随机抽检上述诊断芯片，必须满足下例条件才是合格产品。
3.1  对检测监控系统(由4个对照元素构成)：
1)    821阳为阳性对照1，该植物基因的 RNA在抽提血清RNA时按一定的比例加入到待检的血清样品中，并随着实验流程进行逆转录。若杂交后该样品有杂交信号为正常。   
2)    1SPOT阴性对照1，若杂交后检测无信号，表明点样液无污染。
3)    821阴为阴性对照2，若杂交后检测无信号，表明正常。
4)    413为阳性对照2，该植物基因DNA在PCR扩增掺入荧光底物时按一定的比例加入到逆转录的产物中，以检测荧光底物的掺入效率。若杂交后该样品有杂交信号为正常。
3.2  对疾病诊断系统：
1)    正常血清不产生任何杂交信号。
2)    HBV阳性血清在HBV区应为阳性(即有杂交信号) ，在HCV区应为阴性(即无杂交信号)。
3)    HCV阳性血清在HCV区应为阳性(即有杂交信号) ，在HBV区应为阴性(即无杂交信号)。
4)    HCV和HBV阳性血清在HCV和HBV区均为阳性(即有杂交信号)。

诊断芯片检测过程的SOP
1.    血清DNA和RNA模板的抽提
1)    取血清50 µl,加入抽提液100 µl,与100 µl的氯仿-异戊醇振荡混匀
2)    2000 rpm离心10分钟
3)    小心吸取上清( 切不可将酚吸上)
4)    加入等体积的异丙醇及2 µl的tRNA,混匀
5)    -20℃沉淀1小时
6)    13000 rpm,离心15分钟
7)    弃上清,加400 µl的75%的乙醇,13000 rpm 离心5分钟后晾干
其中抽提液成分如下:
异硫氰酸胍                       92.6 g
    柠檬酸钠(B46)                        13 ml
    超纯水                        26 ml
    十二烷基肌氨酸钠(B17)              13 ml
    β-巯基乙醇(B10)                    1.3 ml
    饱和酚                        130 ml
    tRNA (库存半成品)              8.5 ml

2.    RT-PCR:
1)    向含RNA沉淀的eppendorf管内，依次加入反转录试剂,成分如下：
            超纯水                                    6µl
            821引物                                    0.5ul
            10 µmol/L HCV反转录引物                    0.5 µl
        0.1 mol/L DTT                                1µl
      5 first strand buffer                            2 µl
      10 mmol/L dATP-dGTP-dCTP-dTTP mixture      0.25 µl
用手指弹eppendorf管底部充分溶解沉淀，混匀样品，5000 rpm离心5 sec，置于70℃水浴锅内保温5min。
2)    取出该eppendorf管，置于冰上1 min，5000 rpm离心5 sec。
3)    向该eppendorf管内加入0.2 µl SuperScriptⅡ反转录酶，用手指弹eppendorf管底部10次，混匀样品，5000 rpm离心5 sec，置于42℃水浴锅内保温20 min。
4)    从水浴锅内取出eppendorf管，备用。
吸取10ul的RT产物入0.2ul的薄壁管再加入PCR-mixtureⅠ如下:

  ddH2O                                        31.5 µl
10×Buffer                                        5  ul
10mmol/L dNTP                                    1ul
  10mmol/L HCV primer                              1ul
10mmol/L 821引物                                    1ul
  Taq酶                                            0.5ul
将薄壁管置于MJ Research PTC-225 PCR仪中按下列程序进行PCR反应：
          ①95℃    1.5 min
          ②95℃    30 sec       
          ③55℃    30 sec       
          ④72℃    1min   
          ⑤Goto② for 35 cycles       
          ⑥72℃    5 min       
4. PCR标记探针
吸取5 µl步骤3中制备的PCR产物于0.2 ml 薄壁管管中，并加入PCR-mixtureⅡ试剂,成分如下：

ddH2O                  30µl
10 Buffer                  5 µl
10 mmol/L dATP-dGTP-dCTP mixture 1 µl
1 mmol/L dUTP 1 µl
10 µmol/L HCV primer mixture
HBV primer mixture
812 primer mixture
413 primer mixture                  各 1 µl
413PCR产物 1 ul
尿嘧啶糖基化酶 0.5U
再加入标记试剂:
0.1 mmol/L Cy5-dUTP                  1µl
Taq酶                          0.5 µl
用手指弹eppendorf管底部10下，混匀样品。
1)        将薄壁管置于MJ Research PTC-225 PCR仪中按下列程序进行PCR反应：
①95℃ 1.5 min
②95℃ 30 sec
③58℃ 30 sec
④72℃ 30sec
⑤Goto② for 35 cycles
⑥72℃ 5 min
⑦4℃ forever（待机）
⑧END
2)        取出薄壁管，-20℃蔽光保存。
4. 杂交
1)        将3中制备的探针于真空抽干机中抽干，加入6.6µl预热的杂交试剂Ⅰ溶液，在避光条件下充分振荡溶解探针，再加入6.6ul杂交试剂Ⅱ,混匀后于5000 rpm离心10 sec。
2)        将溶解的探针和待杂交的玻片置于95℃的水浴锅内变性2min。
3)        将变性好的探针避光冰浴, 将变性好的玻片插入到盛有无水乙醇的染色缸内室温放置30 sec，取出, 置于95℃水浴锅外罩上烤干。
4)        取13 µl的上述探针，滴于玻片上，用镊子上端将1818mm 盖玻片盖于其上，玻片置于专用玻片盒中，封上PARAFILM。
5)        将玻片盒置于6层纱布的湿润的饭盒内，将饭盒置于Robbins Model 1000杂交炉内，42℃杂交，3 hr。
6)        立即放入盛有2 SSC+0.2% SDS溶液的烧杯中，使盖玻片自然脱落。
7)        准备两个染色缸和一个500ml烧杯(内置玻片架)，分别装有1SSC+0.2%SDS，1SSC+0.2%Tween-20，0.1 SSC,两个染色缸放入60℃水浴锅中。烧杯置于磁力搅拌器上.
8)        将玻片依次浸入以上三个染色缸中洗涤10 min,在烧杯中搅拌洗涤10分钟.
9)        避光晾干后扫描。
注：Cy5对光敏感，因此操作时尽量避光。
5. 结果分析
将诊断芯片插入ScanArray 3000扫描仪中进行扫描，并使用Imagene软件分析杂交结果。扫描结果显示检测监控系统中阳性对照有荧光信号; 阴性对照没有荧光信号，再在疾病诊断系统中根据信号的有无来判断待测样品是阴性还是阳性。

诊断芯片试剂配制的SOP
一、主要试剂的配置
1.        诊断芯片核酸抽提液配方
异硫氰酸胍          92.6 g
柠檬酸钠(B46)                  13 ml
超纯水 26 ml
十二烷基肌氨酸钠(B17)                13 ml
β-巯基乙醇(B10)                1.3 ml
饱和酚 130 ml
tRNA (库存半成品) 8.5 ml
注：4℃保存；单管分装 500 µl RNA提取液＋500 µl氯仿:异戊醇(49:1)；DNA病毒抽提液中饱和酚换为平衡酚。
1)        tRNA配制：tRNA 1 mg +超纯水 2 ml