主题：【分享】化妆品中巯基乙酸的检测方法(离子色谱法)

化妆品中巯基乙酸的检测方法修订说明

根据中国食品药品检定研究院《化妆品卫生规范》修订项目工作安排，我所承担“巯基乙酸的检测方法（离子色谱法）修订”项目，现已完成修订工作，修订说明如下：

1    修订的必要性：
巯基乙酸(Thioglycolic acid，简称TGA)又称硫代乙醇酸、氢巯基乙酸、巯基醋酸，分子式C2H4O2S，分子量：92.12，外观为无色油状透明液体，有特异臭味，熔点：-16.5℃，沸点：123℃，可与水、醇、醚以任何比例混合，在空气中迅速氧化，质量分数小于70%的巯基乙酸水溶液在室温下贮藏稳定。
巯基乙酸可用于制备烫发剂和脱毛剂，巯基乙酸的钠盐、钙盐或铵盐在碱性作用下，能对皮肤快速脱毛，与传统的碱金属或碱土金属的硫化物做脱毛剂相比，对皮肤刺激温和，几乎无臭，赋香容易，脱毛时间短，效果好。巯基乙酸在碱性条件下有较强的还原作用，能与头发中的胱氨酸反应，切断胱氨酸的( - S - S - ) 键，生成易于卷曲的半胱氨酸。因此，巯基乙酸在烫发、脱毛类化妆品中一直被广泛应用，但是用量过大会导致头发干燥、易断，所以使用时需控制其含量，以免使烫发剂变成脱毛剂，造成毛发脱落的严重后果。同时，巯基乙酸也属于高毒类物质，对皮肤、眼睛有较强的刺激作用，在2007版《化妆品卫生规范》中巯基乙酸及其盐类、酯类被定为限用物质，根据作用效果不同而限量各异。
现行《化妆品卫生规范》（2007年版）巯基乙酸测定的第一法为离子色谱法，操作主要可分为两部分，即巯基乙酸标准溶液标定和离子色谱测定。其巯基乙酸标准溶液标定的方法为直接滴定法，该法步骤较繁琐，需先以重铬酸钾基准物质配制重铬酸钾标准溶液→用重铬酸钾标准溶液标定硫代硫酸钠标准溶液→用硫代硫酸钠标准溶液标定碘标准溶液→用碘标准溶液标定巯基乙酸溶液，溶液颜色由无色变为浅蓝色作为碘标准溶液标定巯基乙酸标准溶液滴定终点的判定依据。实际操作中发现终点的颜色变化过程较长突跃不明显，易导致操作者对终点颜色判定尺度把握不一，有的会以浅紫色为滴定终点，有的会以浅蓝色为滴定终点，同时振摇力度和滴定速度也影响颜色的变化，也可能导致对终点的判断，最终影响标准溶液标定结果的准确性，进而影响离子色谱测定样品的准确性。
同时，现标准规定配制的巯基乙酸标准储备溶液浓度为0.01mol/L（1g/L），而标定用的碘标准溶液为0.05mol/L，浓度差距较大（巯基乙酸与碘的反应当量为2:1），会增加滴定误差，不够合理。
因此，需对巯基乙酸标准溶液标定方法部分进行修订，离子色谱测定部分尚未发现问题，未作修改。
2  起草依据及文献
    （1）《化妆品卫生规范》（2007年版）
    （2）化妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范
（3）郑星泉等，化妆品卫生检验手册，北京：化学工业出版社出版社，2003，105-107
（4）钟志雄等，离子色谱法测定化妆品中巯基乙酸的研究，卫生研究，2004,33（4）:491～493.
（5）张展，巯基乙酸的提纯工艺研究与巯基乙酸铵合成开发，2007

3  修订原则
    本次修订方法兼具顾可行性和合理性，将直接滴定法改为终点更明确的剩余滴定法，修改了巯基乙酸标准储备溶液的浓度，使之与碘标准溶液更匹配，方法的可操作性更强，结果更加准确。尽量采用目前化妆品检测实验室普遍具备的分析技术，并选择准确、可行、便于实际操作的分析条件，保证检测方法的准确性和重现性。

4  修订过程
中国食品药品检定研究院于2014年6月委托我所进行巯基乙酸检测方法的修订和验证工作。我所在原有实验数据的基础上，通过查阅国内外相关文献资料，重点考察了现有的《化妆品卫生规范》（2007年版）巯基乙酸的检测方法中巯基乙酸标准储备溶液的标定。通过大量的实验工作和征求多家检验机构的意见，初步形成了巯基乙酸的测定方法（离子色谱法）修订的方案。2014年7月，中国食品药品检定研究院组织召开专家论证会，经专家评议认为该方法修订方案基本合理，能够满足化妆品中巯基乙酸的检测要求，同时提出了相关修改意见。根据专家论证会意见，我所对修订方案进行了完善，并按方案完成了方法修订，并将修订后的巯基乙酸的检测方法提请广东省食品药品检验所、江苏省疾病预防控制中心和辽宁省药品检验检测院进行复核。

5  重点说明的问题
    （1）关于检测方法的体例。本检测方法的体例主要参照《化妆品卫生规范》（2007年版）的卫生化学检验方法的体例，力求统一协调及便于化妆品检验领域相关检验人员的阅读和实际操作。
    （2）关于检测方法的验证。
本检测方法为容量法中的剩余碘量法，主要从三个方面验证：①满足GB/T 601-2002 化学试剂 标准滴定溶液的制备 中技术指标要求：相同条件下单人4平行测定结果极差的相对值不大于重复性临界极差[CrR95(4)]的相对值0.15%，双人8平行测定结果极差的相对值不大于重复性临界极差[CrR95(4)]的相对值0.18%；②与自动电位滴定法比较，对手动初、复标巯基乙酸标准储备溶液浓度的8组数据与自动电位滴定仪测定巯基乙酸标准储备溶液浓度的8组数据进行t检验，P单尾=0.108及P双尾=0.217均大于0.05，即两种标定方法的结果没有显著差异。③提请三家实验室复核，复核结果表明，本次修订后的方法，其滴定终点更易判定，滴定浓度设置更为合理，方法可行。
（3）关于巯基乙酸所含杂质对标定结果影响的说明
根据文献《巯基乙酸的提纯工艺研究与巯基乙酸铵合成开发》，在工业化生产巯基乙酸的方法中普遍存在副产物二硫代二乙酸（HOOCCH2SSCH2COOH，简称DTDGA），二硫代二乙酸是巯基乙酸的氧化产物，其结构中不含“-SH”基团，不会被碘氧化，故对巯基乙酸标准溶液的标定结果无影响。

化妆品中巯基乙酸的检测方法编制说明

1  任务来源
根据中国食品药品检定研究院与深圳市药品检验所签订的合作协议，深圳市药品检验所承担巯基乙酸的测定方法（离子色谱法）的修订项目。
2  研究背景
巯基乙酸(Thioglycolic acid，简称TGA)又称硫代乙醇酸、氢巯基乙酸、巯基醋酸，分子式C2H4O2S，分子量：92.12，外观为无色油状透明液体，有特异臭味，熔点：-16.5℃，沸点：123℃，可与水、醇、醚以任何比例混合，在空气中迅速氧化，质量分数小于70%的巯基乙酸水溶液在室温下贮藏稳定。
巯基乙酸可用于制备烫发剂和脱毛剂，巯基乙酸的钠盐、钙盐或铵盐在碱性作用下，能对皮肤进行快速脱毛，与传统的碱金属或碱土金属的硫化物做脱毛剂相比，对皮肤刺激温和，几乎无臭，赋香容易，脱毛时间短，效果好。巯基乙酸在碱性条件下有较强的还原作用，能与头发中的胱氨酸反应，切断胱氨酸的( - S - S - ) 键，生成易于卷曲的半胱氨酸，因此，巯基乙酸在烫发、脱毛类化妆品中一直被广泛采用，但是用量过大会导致头发干燥、易断，所以使用时要控制其含量，以免使烫发剂变成脱毛剂，造成毛发脱落的严重后果。同时，巯基乙酸也属于高毒类物质，对皮肤、眼睛有较强的刺激作用，在2007版《化妆品卫生规范》中巯基乙酸及其盐类、酯类被定为限用物质，根据作用效果不同而限量各异。

3  现行方法
现行《化妆品卫生规范》（2007年版）巯基乙酸收载了两种方法，第一法为离子色谱法，第二法为化学滴定法，其中，第一法离子色谱法的操作主要可分为两部分，即巯基乙酸标准溶液标定和离子色谱测定。其巯基乙酸标准溶液标定的方法为直接滴定法，该法步骤较繁琐，先以重铬酸钾基准物质配制重铬酸钾标准溶液→用重铬酸钾标准溶液标定硫代硫酸钠标准溶液→用硫代硫酸钠标准溶液标定碘标准溶液→用碘标准溶液标定巯基乙酸溶液，溶液颜色由无色变为浅蓝色作为碘标准溶液标定巯基乙酸标准溶液滴定终点的判定依据，。实际操作中发现终点的颜色变化过程较长突跃不明显，易导致操作者对终点颜色判定尺度把握不一，有的会以浅紫色为滴定终点，有的会以浅蓝色为滴定终点，同时振摇力度和滴定速度也影响颜色的变化，也可能导致对终点的判断，最终影响标准溶液标定结果的准确性，进而影响离子色谱测定样品的准确性。
同时，现标准规定配制的巯基乙酸标准储备溶液浓度为0.01mol/L（1g/L），而标定用的碘标准溶液为0.05mol/L，浓度差距较大（巯基乙酸与碘的反应当量为2:1），会增加滴定误差，不够合理。
本项目在现有的《化妆品卫生规范》（2007年版）巯基乙酸检测方法的基础上，将巯基乙酸标准溶液标定方法由直接碘量法改为剩余碘量法，即先定量加入过量的碘溶液，使巯基乙酸与碘反应完全，再用已标定的硫代硫酸钠标准溶液滴定剩余的碘，同法做空白校正，以溶液颜色由蓝色变为无色作为滴定终点。
同时，将巯基乙酸标准储备溶液的浓度修订为0.1mol/L(10g/L)，即称取巯基乙酸1.0g，用水稀释并转移至100ml容量瓶中，加入甲醛1ml，加水定容得标准储备溶液。
巯基乙酸的离子色谱测定部分未作修改。

4  项目完成情况
根据中国食品药品检定研究院与深圳市药品检验所签订的合作协议，在现有《化妆品卫生规范》（2007年版）巯基乙酸检测方法（离子色谱法）的基础上，将巯基乙酸标准溶液的标定方法由直接碘量法修改为剩余碘量法，同时将巯基乙酸标准储备溶液的浓度修改为0.1mol/L(10g/L)。
具体工作如下：
（1）建立了用剩余滴定法标定巯基乙酸标准溶液的方法。满足GB/T 601-2002 化学试剂 标准滴定溶液的制备 中技术指标要求：相同条件下单人4平行测定结果极差的相对值不大于重复性临界极差[CrR95(4)]的相对值0.15%，双人8平行测定结果极差的相对值不大于重复性临界极差[CrR95(4)]的相对值0.18%。
（2）本方法负责修订单位为深圳市药品检验所，参与复核验证单位分别为广东省食品药品检验所、江苏省疾病预防控制中心和辽宁省药品检验检测院。验证结果满足《化妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范》相关要求。

5 方法概述
5.1  技术原理：
在巯基乙酸标准溶液中先加入定量、过量的碘标准溶液，待碘与巯基乙酸反应完全后，然后用硫代硫酸钠标准溶液滴定剩余的碘，以求出巯基乙酸的含量。反应过程为：
2HSCH2COOH  +  I2  →  HOOCH2C-S-S-CH2COOH  +  2HI
            2Na2S2O3  +  I2  →  Na2S4O6  +  2NaI
5.2  试剂：
5.2.1  巯基乙酸，批号：STBB6196，含量：99.60%，来源：Sigma-Aldrich。
5.2.2  三氯甲烷，分析纯。
5.2.3  淀粉溶液：称可溶性淀粉1g用水5ml调成溶液后加入沸水95ml，煮沸，临用现配。
5.2.4  重铬酸钾标准溶液[c(1/6K2Cr2O7)=0.1000mol/L]：准确称取已于120℃±2℃电烘箱中干燥至恒重的重铬酸钾基准物质4.9031g，溶于水并转移至1000ml量瓶中，定容至刻度。
5.2.5  硫代硫酸钠溶液(0.1mol/L)：称取硫代硫酸钠（Na2S2O3▪5H2O）26g（或无水硫代硫酸钠16g）溶于1000ml新煮沸放冷的水中，加入氢氧化钠0.4g或无水碳酸钠0.2g，摇匀，贮存于棕色瓶内，放置两周后过滤，用重铬酸钾标准溶液标定其准确浓度，标定方法如下：
准确吸取重铬酸钾标准溶液25.00ml于500ml碘量瓶中，加碘化钾2.0g和硫酸溶液（10%）20ml，立即密塞，摇匀，于暗处放置10min。加入水150ml，用硫代硫酸钠溶液滴定，直至溶液呈淡黄色时，加入淀粉溶液（10g/L）2ml，继续滴定至蓝色变为亮绿色。同时做空白试验。按下式计算硫代硫酸钠溶液的浓度。
c（Na2S2O3）= CX25.0/(V1-V0)
    式中：c（Na2S2O3）——硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L；
C——重铬酸钾标准溶液的浓度[c(1/6K2Cr2O7)]，mol/L；
V1——硫代硫酸钠溶液的用量，ml；
V0——空白试验硫代硫酸钠溶液的用量，ml。
5.2.6  碘溶液（0.05mol/L）：称取碘13.0g和碘化钾35g，加水100ml，溶解后加入盐酸3滴，用水稀释至1000ml，过滤后转入棕色瓶。
5.2.7  巯基乙酸标准储备溶液（10g/L）：称取巯基乙酸标准品1.0g，用水稀释转移至100ml容量瓶中，加入甲醛1ml，加水定容得标准储备溶液，临用时采用剩余滴定法标定标准储备溶液，标定方法如下：
准确吸取巯基乙酸标准储备溶液10.00ml，置于250ml碘量瓶中，加入水10ml，盐酸10ml，精确加入碘溶液（0.05mol/L）20.00ml，混匀，于暗处放置3分钟，用硫代硫酸钠标准溶液滴定，溶液颜色变为浅黄色时，加入淀粉溶液（10g/L）2ml，继续滴定至蓝色消失即为终点。同时做空白试验，按下式计算巯基乙酸标准溶液的浓度。
c（HSCH2COOH）= 92.1xcx(v0-v1)X1000X1000/(VX1000 )
式中：c（HSCH2COOH）——巯基乙酸标准储备溶液的浓度，μg/ml；
      C ——硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L；
      V0 ——空白试验硫代硫酸钠标准溶液的用量，ml；
      V1 ——硫代硫酸钠溶标准液的用量，ml；
      V ——巯基乙酸标准溶液的体积，ml；
      92.1——巯基乙酸的摩尔质量，g/mol。

6  方法研究
本次应用的方法为碘量法中的剩余碘量法，主要从以下两个方面验证：
6.1 初、复标重复性考察
滴定管：25ml (编号128500)
移液管：10ml (编号135001313)，校正值为0.009ml，校正后体积为10.009ml
计算：c（HSCH2COOH）=(V0-V1)XC/V 
式中：c（HSCH2COOH）——巯基乙酸标准储备溶液的浓度，mol/L
V0——空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的用量，ml；
V1——巯基乙酸标准储备溶液消耗硫代硫酸钠标准溶液的用量，ml；
C——硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L；
V——取用巯基乙酸标准溶液的用量，ml；
初标极差的相对值：
             
复标：结果见表2
表2  巯基乙酸标准储备溶液复标结果
复标份数 取用巯基乙酸标准储备溶液的用量（V, ml） 硫代硫酸钠标准溶液浓度
（c, mol/L） 空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的用量（V0, ml） 巯基乙酸标准储备溶液消耗硫代硫酸钠标准溶液的用量（V1, ml） 巯基乙酸标准储备溶液的浓度（mol/L） 平均值（mol/L）
1 10.009 0.1030 19.44 10.18 0.095292 0.095215
2  19.44 10.19 0.095189
3  19.44 10.19 0.095189
4  19.44 10.19 0.095189
复标极差的相对值：
             
初、复标巯基乙酸标准溶液浓度平均值：0.095228mol/L  0.09523 mol/L
初、复标极差的相对值:
             
满足GB/T 601-2002 化学试剂 标准滴定溶液的制备 中技术指标要求：相同条件下单人4平行测定结果极差的相对值不大于重复性临界极差[CrR95(4)]的相对值0.15%，双人8平行测定结果极差的相对值不大于重复性临界极差[CrR95(4)]的相对值0.18%。
6.2 与自动电位滴定法比较
使用瑞士梅特勒T50自动电位滴定仪，配备DMi140-SC铂电极
本次滴定的化学反应均为氧化还原反应，可用自动电位滴定仪滴定加以验证，滴定曲线见图1、2，标定结果见表3。

图1.空白校正试验的滴定曲线

图2.标定巯基乙酸标准储备溶液试验的滴定曲线
表3  巯基乙酸标准储备溶液自动电位滴定法标定结果
滴定份数 取用巯基乙酸标准储备溶液的用量（V, ml） 硫代硫酸钠标准溶液浓度
（c, mol/L） 空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的用量（V0, ml） 巯基乙酸标准储备溶液消耗硫代硫酸钠标准溶液的用量（V1, ml） 巯基乙酸标准储备溶液的浓度（mol/L） 平均值（mol/L）
1 10.009 0.1030 19.433 10.179 0.095230 0.09520
2    10.182 0.095200
3    10.180 0.095220
4    10.176 0.095261
5    10.185 095169
6    10.188 0.095138
7    10.186 0.095158
8    10.182 0.095200
对手动初、复标巯基乙酸标准储备溶液浓度的8组数据与自动电位滴定仪测定巯基乙酸标准储备溶液浓度的8组数据进行t检验，结果见表4：
表4  t-检验结果
t-检验: 双样本等方差假设 
手动滴定 电位滴定
平均 0.095228 0.095197
方差 2.84E-09 1.65E-09
观测值 8 8
合并方差 2.24E-09
假设平均差 0
df 14
t Stat 1.293115
P(T<=t) 单尾 0.108452
t 单尾临界 1.76131
P(T<=t) 双尾 0.216903
t 双尾临界 2.144787
P单尾=0.108及P双尾=0.217均大于0.05，即两种标定方法的结果没有显著差异。

7 化妆品中巯基乙酸含量测定——离子色谱法
7.1 仪器：戴安ICS2000离子色谱仪
XS204电子天平
涡旋振荡器
超声波清洗器
高速离心机
7.2 色谱条件
    色谱柱：AS11-HC（250×4mm），AG11-HC（50×4mm）
抑制器：ASRS ULTRAⅡ2mm
淋洗液： 25mmol/L氢氧化钠溶液+1%甲醇混合液
淋洗液流速：0.42ml/min
抑制模式：外接水，自动抑制电流50mA
氮气流速（压力）：6psi
柱温：30℃
进样量：25μl
检测器：抑制型电导检测器
7.3 巯基乙酸标准使用溶液制备
精密量取巯基乙酸标准储备溶液（5.2.7）10ml→10.00ml（1g/L）
S1：量取上述巯基乙酸标准溶液（1g/L）5.00ml→25.00ml（200mg/L）
S2：量取上述巯基乙酸标准溶液（1g/L）5.00ml→50.00ml（100mg/L）
S3：量取上述巯基乙酸标准溶液（1g/L）5.00ml→100.00ml（50mg/L）
S4：量取上述巯基乙酸标准溶液（1g/L）2.00ml→100.00ml（20mg/L）
S5：量取上述巯基乙酸标准溶液（1g/L）1.00ml→100.00ml（10mg/L）
7.4 样品测定
从市场上购得4种脱毛或电发产品进行巯基乙酸的含量测定，准确称取①、②0.3g，③0.5g，④0.4g，置于100ml具塞比色管中，加水至刻度，膏状样品用涡旋振荡器振摇均匀，超声波清洗器提取20min，加入三氯甲烷2ml，轻轻振摇，静置，过滤，取续滤液作待测样液，进样，结果见表5：
表5  样品测定结果
产品名称 深圳市药品检验所/% 广东省食品药品检验所/% 辽宁省检验检测院/% 江苏省疾病预防控制中心/%
①薇婷全新香氛凝翠脱毛膏 3.6 3.5 3.5 3.9
②沐浴用脱毛乳 3.3 3.3 3.3 3.5
③弹力多姿雅烫发水 1.4 1.4 1.5 1.4
④圣西娅牌脱毛霜 1.9 1.8 1.8 1.7

8 复核情况
参与复核检验的机构分别为广东省食品药品检验所、辽宁省药品检验所、江苏省疾病预防控制中心，三家机构均未对修订方法提出异议，巯基乙酸标准溶液的标定结果见表6
表6  巯基乙酸标准溶液的标定结果
机构名称 初标4平行测定结果极差的相对值不大于重复性临界极差[CrR95(4)]的相对值（%） 复标4平行测定结果极差的相对值不大于重复性临界极差[CrR95(4)]的相对值（%） 初、复标4平行测定结果极差的相对值不大于重复性临界极差[CrR95(4)]的相对值（%）
广东省食品药品检验所 0.10 0.10 0.10
辽宁省药品检验检测院 0.10 0.10 0.10
江苏省疾病预防控制中心 0.08 0.08 0.08
广东省食品药品检验所，4批脱毛或电发产品巯基乙酸的含量测定结果与本所基本一致。
辽宁省药品检验检测院认为本次修改后，滴定终点更易辨别，滴定浓度更为合理，方法可行，4批脱毛或电发产品巯基乙酸的含量测定结果与本所基本一致。
江苏省疾病预防控制中心认为将现行方法中直接滴定法改为剩余滴定法，简化了操作步骤，滴定终点更加易于观察和判断。同时将标定的标准溶液浓度由0.01mol/L修改为0.1mol/L，减小了滴定误差。方法合理、可行。4批脱毛或电发产品巯基乙酸的含量测定结果与本所基本一致。