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主题：【求助】如何分离单抗轻重链

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lingyou
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发表于：2015/02/03 13:22:20 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
悬赏金额：20积分 状态： 已解决
做毛细管电泳的新手，求能够有效分离单抗轻重链并进行回收的实验方法，商品化的试剂盒最好。现在在做的一个单抗异质性很多，希望能将轻重链分离后再检测
推荐答案：nini2006回复于2015/02/03
如果光是检测，做的还是很多的。请参考下帖中第1部分第24份资料：
http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20120831/4218338/

但是回收的话，可能有点难度。
补充答案：

CEcret回复于2015/02/03

有几点说明的：
1。cIEF分离的是charged variants，你获得10个以上的峰都很正常，因为抗体的修饰本来就很多。你把轻重链分开后分别检测，至少重链的修饰还是很多。
2。电泳的CE-SDS可以分离轻重链，但是受进样量限制，你收集的量远不足以再次分析，且含有SDS和polymer的基质也不利于cIEF分析。
3。我能够想到的办法，采用SEC手段（这样能够保有蛋白不变性）分离HC,LC，分别收集后进行cIEF分析，这中间你还需要超滤脱盐。

不知道是不是对你有所帮助。

该帖子作者被版主 nini2006加 5积分， 2经验，加分理由：发帖
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2015/2/3 14:30:45 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
如果光是检测，做的还是很多的。请参考下帖中第1部分第24份资料：
http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20120831/4218338/

但是回收的话，可能有点难度。
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lingyou
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2015/2/3 14:42:00 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
级别太低不能查看精华帖，哭
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nini2006
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2015/2/3 14:48:13 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 lingyou(v2983592) 发表:

级别太低不能查看精华帖，哭


试试这个链接：

http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20140721/5389364/
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lingyou
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2015/2/3 14:57:13 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
这个我看过啦，我用的也是beckman试剂盒，做CE-SDS没问题。现在问题是CIEF峰太多太杂，所以希望能有方法把单抗轻重链分离后分别CIEF检测，能降低谱图分析的复杂性。不知道我描述的是不是清楚
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CEcret
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2015/2/3 15:16:17 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
有几点说明的：
1。cIEF分离的是charged variants，你获得10个以上的峰都很正常，因为抗体的修饰本来就很多。你把轻重链分开后分别检测，至少重链的修饰还是很多。
2。电泳的CE-SDS可以分离轻重链，但是受进样量限制，你收集的量远不足以再次分析，且含有SDS和polymer的基质也不利于cIEF分析。
3。我能够想到的办法，采用SEC手段（这样能够保有蛋白不变性）分离HC,LC，分别收集后进行cIEF分析，这中间你还需要超滤脱盐。

不知道是不是对你有所帮助。
该帖子作者被版主 nini2006加 3积分， 2经验，加分理由：应助
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lingyou
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2015/2/3 15:58:49 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
SEC的方法实验过了，问题在于单抗用巯基乙醇处理后HPLC检测发现出现了非常高的聚体峰，也就是二硫键又重新组合了，导致轻重链含量很低。想加碘乙酰胺封闭二硫键，结果出现了沉淀。所以想问各位大神有没有其他的方法，试剂盒最好啦！新手，基础知识储备不足
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nini2006
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2015/2/3 23:36:08 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 lingyou(v2983592) 发表:
SEC的方法实验过了，问题在于单抗用巯基乙醇处理后HPLC检测发现出现了非常高的聚体峰，也就是二硫键又重新组合了，导致轻重链含量很低。想加碘乙酰胺封闭二硫键，结果出现了沉淀。所以想问各位大神有没有其他的方法，试剂盒最好啦！新手，基础知识储备不足
你如果是要回复上面的发言，可以点击该回帖所在楼层的“回复本帖”按钮，这样，他在下次登录的时候就能收到提醒，利于及时跟进。
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2015/2/3 23:36:56 Last edit by nini2006
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2015/2/3 23:40:30 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 lingyou(v2983592) 发表:
SEC的方法实验过了，问题在于单抗用巯基乙醇处理后HPLC检测发现出现了非常高的聚体峰，也就是二硫键又重新组合了，导致轻重链含量很低。想加碘乙酰胺封闭二硫键，结果出现了沉淀。所以想问各位大神有没有其他的方法，试剂盒最好啦！新手，基础知识储备不足
所以你目前的问题不是如何分离，而是如何防止抗体聚集。既然你分离后还要收集，建议你不要用CE了。还是用SEC吧，把聚集问题解决了就好了。
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lingyou
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2015/2/4 10:17:18 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 nini2006(nini2006) 发表:
原文由 lingyou(v2983592) 发表:
SEC的方法实验过了，问题在于单抗用巯基乙醇处理后HPLC检测发现出现了非常高的聚体峰，也就是二硫键又重新组合了，导致轻重链含量很低。想加碘乙酰胺封闭二硫键，结果出现了沉淀。所以想问各位大神有没有其他的方法，试剂盒最好啦！新手，基础知识储备不足
你如果是要回复上面的发言，可以点击该回帖所在楼层的“回复本帖”按钮，这样，他在下次登录的时候就能收到提醒，利于及时跟进。


谢谢指导
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lingyou
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2015/2/4 10:19:29 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 nini2006(nini2006) 发表:
原文由 lingyou(v2983592) 发表:
SEC的方法实验过了，问题在于单抗用巯基乙醇处理后HPLC检测发现出现了非常高的聚体峰，也就是二硫键又重新组合了，导致轻重链含量很低。想加碘乙酰胺封闭二硫键，结果出现了沉淀。所以想问各位大神有没有其他的方法，试剂盒最好啦！新手，基础知识储备不足
所以你目前的问题不是如何分离，而是如何防止抗体聚集。既然你分离后还要收集，建议你不要用CE了。还是用SEC吧，把聚集问题解决了就好了。


对的，现在就是想要一个能够还原单抗还不会产生聚体的有效方法，巯基乙醇加碘乙酰胺很经典可惜不适用
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