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主题：那位高人能指导小弟一下!

浏览0 回复3 电梯直达
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发表于：2006/11/07 10:42:00 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊

最近要做RT-PCR,不知道要注意些什么!
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2007/1/12 16:42:00 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
严格按操作说明，尤其要注意所有器具要干净，不能有污染。
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2007/1/17 14:35:00 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
我的体会是除了引物设计和退火温度是PCR的关键外，RT-PCR另一个要注意的是核酸样本的制备，即RNA，要注意不能污染DNA，如污染DNA会影响可比性或出现假阳性或者是多条带（引物设计不在一个外显子内的时候）。设置无RT的对照可以帮助判定是否RNA样本是否污染了DNA。
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agneswu
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2007/2/1 21:01:00 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1, RNA质量的好坏，主要是避免RNA酶降解RNA咯，玻璃器皿和研钵用180度干热

灭菌，塑料器皿用DEPC水处理，RNA质量用OD260/280以及RNA电泳特征带指示，

还有最好避免DNA污染（可用DNA酶消化）。
2，反转录尽量用等量的RNA,那样后面调内参容易
3，内参（一般管家基因都可以，循环数不要太高，太高到了平台期就不准了）
4，RT-PCR一般需要提供两个循环数的条带，比如24,28
5，严格设置各类对照组
6，有条件做northern或者荧光定量吧
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