主题：【分享】高效液相色谱基线及其影响因素

1. 概述
色谱基线也常被称作背景噪音，是在无样品组分通过色谱检测器时，检测器响应信号的随机分布。基线噪音的大小直接影响色谱分析方法的检测灵敏度以及对杂质的检出能力，如纯度测试以及痕量物质残留检测方法等。
对于液相色谱而言，等度洗脱模式下，由于流动相的组成保持一致，其折光率不变，因而基线比较平坦，噪音比较小。但该模式的杂质检测能力一般且方法运行时间比较长，不适合于多组分或基质复杂样品的分析；梯度洗脱模式下，基线随流动相组成的变化而不断变化，基线噪音比较大，但其具有明显缩短分析时间以及增加杂质的检出能力(梯度洗脱时，色谱峰被梯度变化的流动相纵向压缩，从而其峰宽减小，峰高增加)的特点，使其日益成为最为常见的液相色谱操作方式。
正常的基线噪音一般具有连续变化的特点，如下图1A所示；基线噪音的测试可按照下图1B所示方法进行。

2. 基线噪音影响因素
基线噪音的高低受到多种因素的影响，其中既受到仪器本身硬件，如泵、混合器、阻尼器、柱温箱、灯能量以及检测器等的影响，也受到诸如流动相的组成以及所使用的添加剂或缓冲盐的种类等因素的影响。
2.1 检测器及其设置对基线噪音的影响
检测器及其设置对于基线轮廓以及噪音水平的影响主要体现与检测波长的设置及其流通池的污染程度，如下图2所示。

如上图2A所示，随流动相的组成的变化，流动相的吸收光谱亦随之变化，因此在不同的检测波长下，其基线的轮廓表现出很大的不同，如图2B。
检测波长的设置一般需要避开流动相的截止波长10-20nm左右比较合适，同时基线噪音水平也受到检测波长(一般以最大吸收波长作为检测波长)以及参比波长的影响(如下图3以及表1所示)。因此，为了减小基线噪音水平提高方法检测灵敏度，推荐对参比检测波长进行优化。

从上图3以及下表1可以看出，在设置了参比波长(360 nm，20 nm)之后，基线噪音减小了一倍左右。参比波长以及参比波长带宽的设置可以参考其他资料并结合实际情况进行。检测器流通池对基线噪音的影响主要集中于流动相或样品组分对于石英视窗的污染，进而导致基线噪音变大。

此外，检测器的灯一般为氘灯，其有效时长为2000h左右，当灯的能量不足的时候，基线噪音将明显增大。此时则需要对氘灯进行更换。
2.2 泵、混合器以及阻尼器对基线噪音的影响
一般地，液相色谱仪配置高压二元泵或者低压四元泵，而泵的冲程体积以及混合器(二元高压泵)的体积大小，均会对色谱基线噪音水平产生影响，特别是在梯度洗脱的时候。一般地，泵的冲程体积越小以及混合器的体积相对越大，由输液造成的脉冲相对越小，对于梯度变化的响应能力越高，基线越平缓，如下图4所示。

此外，在应用二元泵的时，需要注意的一点是，当二元混合中的其中一元流动相的比例小于5%的时候，特别是在使用正相等度洗脱对一些医药中间体及终产品进行手性拆分的时候，最好使用单泵预混合的方式(下图5A)。避免由于泵在低比例时泵液精度相对较差，而导致色谱基线出现冲程相关峰，如下图5B所示。

由于泵发生故障而引起色谱基线噪音比较大的情况，归结起来主要有泵密封垫圈磨损，引起轻微的漏液以及泵内进入了气泡等；柱塞杆磨损或损坏导致的泵液不准；单向阀磨损或者轻微漏液。以上几种情况均会引起色谱基线发生大的波动，对分析方法产生影响。
如泵单向阀轻微漏液或者有气泡进入泵内，色谱基线均有可能出现Cycle型的波动，柱前压亦会出现相应的波动，此时可以通过减小流速或增大流速，观察频率是否会随着流速的改变而改变，以确认是否是由泵的原因引起的。
此外，流动相中的气泡会最终在检测器处被检测到，一般其更加类似于一个色谱峰，呈现正峰或倒峰，一般会伴随有前沿或者拖尾现象。此时可通过停泵，观察基线是否连续稳定，判断基线的波动是否由于气泡导致的。
当流动相由色谱柱流出并进入流通池的时候，两部分的温度差以及流通池内的温度的变化，也会使色谱基线的噪音水平增加，可参照前期内容进行理解。
2.3 流动相添加剂对基线噪音的影响
流动相在使用之前确保经过脱气处理，使用未经脱气处理的流动相，基线波动比较厉害，噪音水平较高，有时也会出现鬼峰。下图比较了脱气与否以及脱气方式对于基线噪音的影响。

在对一些极性可解离化合物进行HPLC分析的时候，往往需要向流动相中添加有机酸碱改性剂，如TFA等。在使用有机添加剂的时候，最好是在水相以及有机相中均添加的方式，避免由于有机添加剂混合不均匀导致的色谱基线噪音过大的情况发生。
TFA在水中的紫外吸收光谱与在乙腈中的紫外吸收光谱存在差异，因此在梯度洗脱时，基线的形状随梯度设置以及检测波长设置的不同，而呈现出不同的形状。特别地，当起始有机相比例比较低(如10%以下)，梯度斜率又比较大的时候，如下图7所示，流动相B从5-95%(20min)，检测波长设置为210 nm(图7A)与254 nm(图7B)时，在使用TFA作为有机添加剂的时候。在210 nm检测波长下，色谱基线在3.5-5 min内出现了一个较大的上扬，在254 nm的检测波长下，该现象不明显。

上图的这种现象，总的来说与以下几个方面有关：(1)色谱柱键合相的碳链长度，C18 > C8 > C4；(2)有机相起始比例，起始比例越高，越不明显；(3)TFA的浓度，浓度越大越明显；(4)泵的冲程大小，冲程越小越不明显；(5)检测波长，越大越不明显；(6)混合器的体积，越小越明显。
此外，在使用强紫外吸收的添加剂的时候，注意对色谱图上的系统峰进行区分。如下图8A所示，0.1%TFA水以及乙腈为流动相，分别进样比起始流动相洗脱强度弱/强的0.1%TFA溶剂，1-2 min内的正负峰均为系统峰。特别的，当使用其他保留比TFA强的添加剂的时候，如HFBA，需要注意进样之后引起的系统峰，如下图8B中峰1以及峰2均为系统峰且峰1与峰2的面积和理论上为零。

2.4 缓冲盐对基线噪音的影响
在反相液相色谱中常用的缓冲盐主要包括磷酸盐，醋酸铵，甲酸胺，碳酸氢铵，等。其中磷酸盐以其耗费低，纯度高，缓冲pH范围宽(2-3.1，6.2-8.2)，背景吸收低等特点，成为使用最多的盐类；而醋酸铵，甲酸胺，碳酸氢铵等可挥发性盐，则可与MS兼容。
如下图9A与9B所示，使用磷酸盐的时候，其色谱基线特征为在低检测波长下，基线上移，且上移程度与使用的有机相的截止吸收波长有关。此外在使用大于10 mM的磷酸盐的时候，有机相比例较高的条件下，优先选用甲醇作为有机相。

对于醋酸铵等高紫外吸收的缓冲盐，其基线的形状与流动相的配置方式、组成以及使用的检测波长有关，如下图10所示。

只在水相中添加醋酸铵缓冲盐时，随梯度的运行，在低检测波长下，基线整体形状下移比较严重；当在水相以及有机相中各添加等量醋酸铵缓冲盐时，在低检测波长下，基线的整体形状向上漂移，其程度较前者漂移小。
3. 结论
液相色谱基线噪音水平高低不仅与仪器配置有关，如泵的种类，混合器以及流动相的混合模式，检测器设置等，而且与流动相的组成以及添加剂或者缓冲盐的种类与浓度密切相关。基线的整体形状与检测器的检测波长设置以及流动相中缓冲盐、添加剂的种类以及流动相的配置方式关系紧密。了解多种条件下的基线整体形状以及噪音水平高低，对于排除仪器故障有时也大有裨益。
作者信息
Bruce Lee
作者微信号：Lindaring001
作者公众号：Pharma_Analytical