抗生素在防病、治病中的广泛应用为奶牛养殖业持续、快速、健康的发展做出了巨大的贡献，抗生素在牛奶养殖过程中的广泛应用，也不可避免的造成了牛奶中残留有抗生素。随着人们对食品安全的重视,牛奶中各种有害物质的残留受到了消费者的极大关注。慢抗-微生物的检测基于细菌生产抑制的原理。该试剂盒包括一块微孔版，微孔内注有分布了嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和酸碱指示剂的琼脂营养基。当微孔板置于65℃培养时，孢子萌发，细菌生长并代谢产生酸使得琼脂的酸度降低，从而导致琼脂中酸碱指示剂由蓝色（紫色）变为微黄色。如果待检的乳样中含有高于检出限的抗生素残留，则细菌芽孢不会生长，pH指示剂的颜色保持不变。基于以上原理在生产过程中如果出现清洗剂、消毒剂混入牛奶制品中，针对检测结果中出现假阳性现象进行方法验证以及结果分析阐述。

1. 实验材料

1.1仪器、设备

孵育器：65℃±1℃加热器

1.2 药品
1.2.1 慢抗-微生物
1.2.2 碱性清洗剂1：浓度为2.93%；
1.2.3 碱性清洗剂2：浓度为52.20%；
1.2.4 酸性清洗剂1；浓度为43.64%；
1.2.5 消毒剂（伏泰）：浓度为4.44%（主要成分为过氧乙酸）；
1.2.6 消毒剂（双氧水）：浓度为35.81%；
1.3 环境条件
本实验检测条件温度20±5℃，湿度在35-80%，实验室符合检测条件。

2. 实验方法

2.1 样品制备：选取生产车间在线使用的清洗剂及消毒剂人为添加进抗生素已检测合格的灭菌乳中，配制成不同浓度待用。
2.2 分割试剂：确定所需微孔数量，用刀沿微孔外侧划开金属薄膜。注意不要剪开剩余的微孔板上的金属薄膜，因为这会使微孔挥发以致干结。
2.3 取试剂：从塑料框上取下已剪开的微孔条。只需简单地用指尖向上压微孔条，微孔条即可分离出来。
2.4 揭开保护膜：将要使用的微孔板(条)安放到另一个空的白色塑料架上，剥开微孔上的胶粘金属膜。
2.5 加样：将2.1中制备好的样品充分混匀后在每个微孔中加入50 μL牛奶样品。
2.6 密封：用胶粘纸小心地密封微孔板(条)，将其放入到已经预热到65±1℃培养器中。必须确保微孔已经完全密合。
2.7 培养：培养时间大约2h15min～2h45min(具体培养时间参考试剂盒打开后上盖所印“最佳培养时间”)后从微孔侧面观察结果。

3. 实验结果与讨论

结合在线使用清洗剂、消毒剂浓度人为添加在已检测合格的灭菌乳中并进行梯度稀释后进行检测。
3.1 碱性清洗剂类
选用在线清洗剂中所使用的最低浓度点为人为添加目标值进行样品配制，取已配制好的样品进行检测，结果数据如下表：
表一添加碱性清洗剂1的样品检测结果

样品名称	在线使用最低浓度	稀释倍数	稀释终浓度	检测结果
碱性清洗剂1 （2.93%）	0.50%	0	0.5000%	阳性
		5	0.1000%	阳性
		10	0.0500%	阳性
		20	0.0250%	阳性
		40	0.0125%	阴性
		50	0.0100%	阴性
		100	0.0050%	阴性

表二添加碱性清洗剂2的样品检测结果

样品名称	在线使用最低浓度	稀释倍数	稀释终浓度	检测结果
碱性清洗剂2 （43.64%）	2.00%	0	2.0000%	阳性
		5	0.4000%	阳性
		10	0.2000%	阳性
		50	0.0400%	阳性
		100	0.0200%	阳性
		150	0.0133%	阳性
		200	0.0100%	阳性
		250	0.0080%	阳性
		300	0.0067%	阴性

3.2 消毒剂类
选用在线消毒剂中所使用的最低浓度点为人为添加目标值进行样品配制，取已配制好的样品进行检测，结果数据如下表：
表三添加伏泰的样品检测结果

样品名称	在线使用最低浓度	稀释倍数	稀释终浓度	检测结果
伏泰（4.44%）	0.13%	0	0.13%	阴性

表四添加双氧水的样品检测结果

样品名称	在线使用最低浓度	稀释倍数	稀释终浓度	检测结果
双氧水（35.81%）	0.50%	0	0.50000%	阳性
		5	0.10000%	阳性
		10	0.05000%	阳性
		50	0.01000%	阳性
		100	0.00500%	阳性
		130	0.00385%	阳性
		150	0.00333%	阳性
		200	0.00250%	阳性
		300	0.00167%	阳性
		250	0.00200%	阳性
		300	0.00167%	阳性
		400	0.00125%	阳性
		500	0.00100%	阳性
		600	0.00083%	阳性
		700	0.00071%	阳性
		800	0.00063%	阳性
		900	0.00056%	阳性
		1000	0.00050%	阳性
		1100	0.00045%	阳性
		1200	0.00042%	阴性

3.3 证实实验（酸性清洗剂类）
根据慢抗-微生物法检测原理，样品在酸性条件下会导致琼脂中酸碱指示剂变色，以至于样品检测结果会出现假阴性，在实际操作中选用在线清洗剂中所使用的最低浓度点10倍稀释后人为添加目标值进行样品配制，对该理论推理结果进行检测验证，验证结果数据如下表：
表五添加酸性清洗剂1的样品检测结果

样品名称	在线使用最低浓度	稀释倍数	稀释终浓度	检测结果
酸性清洗剂1 （52.20%）	0.5%	10	0.05000%	阴性
		20	0.02500%	阴性
		40	0.01250%	阴性
		60	0.00833%	阴性
		80	0.00625%	阴性

3.4 结果分析
3.4.1 碱性清洗剂从添加浓度来看，当添加离子碱后样品浓度在0.5000%-0.0250%之间检测结果呈阳性，浓度低于0.0125%检测结果呈阴性；当添加AC110碱后样品浓度在2.0000%-0.0080%之间检测结果呈阳性，浓度低于0.0067%检测结果呈阴性。
3.4.2 消毒剂类从添加浓度来看，消毒剂类中伏泰对检测结果影响较小；双氧水影响偏大，当添加样品浓度在0.50000%-0.00045%之间检测结果呈阳性，浓度低于0.00042%检测结果呈阴性。
3.4.3 对于酸性类清洗由于在慢抗-微生物原理中：微孔板置于65℃培养时，孢子萌发，细菌生长并代谢产生酸使得琼脂的酸度降低，从而导致琼脂中酸碱指示剂由蓝色（紫色）变为微黄色，故样品在添加酸性清洗剂后易出现假阴性结果。
4. 结论及注意问题：

4.1 结论
目前乳制品生产工厂在线使用的清洗剂、消毒剂对于使用慢抗-微生物对产品中抗生素检测实验过程中对检测结果影响比较大，其中碱性清洗剂、双氧水对结果影响较为明显。在日常检验中因防止清洗剂、消毒剂的混入导致检测结果的偏离。因此在日常检测过程中对于酸性样品需用1M氢氧化钠将pH值调至6.7～7.0之间进行检测。
4.2 注意问题
4.4.1 慢抗-微生物对抗生素和其他一些抑菌剂类物质十分敏感，如清洗剂、消毒剂或防腐剂。
4.2.1 每次检测中需要准备不含抗生素的阴性样品作为对照样品以便确定慢抗-微生物在孵育过程中的最佳时间。
4.2.2 在日常检测过程中所使用的移液枪枪头必须为污染，且每个样品都需使用新的枪头。
4.2.3 样品检测过程中需防止清洗剂、消毒剂或防腐剂类物质的污染。