主题：【资料】－超高效液相色谱

此时范第姆特方程式的H-u曲线，由图7-14所示



对由粒度dp分别为10μm、5μm、3.5μm、2.5μm和1.7μm固定相填充的色谱柱，对同一实验溶质测定的范第姆特方程式的H-u曲线如图7-15所示。

这些曲线表达了HPLC技术从20世纪70年代至2004年所取得的快速进展。
由式（7-35）可明显看到，随色谱柱中装填固定相粒度dp的减小，色谱柱的H也愈小，色谱柱的柱效也越高。因此，色谱柱中装填固定相的粒度是对色谱柱性能产生影响的最重要的因素。

具有不同粒度固定相的色谱柱，都对应各自最佳的流动相的线速度。在图7-15中，不同粒度的范第姆特曲线对应的最佳线速度为：


由上述数据表明，随色谱柱中固定相粒度的减小最佳线速度向高流速方向移动，并且有更宽的优化线速度范围。因此，降低色谱柱中固定相的粒度，不仅可以增加柱效，同时还可增加分离速度。
   
但是，应当看到在使用小颗粒的固定相时，会使Δp大大增加，使用更高的流速会受到固定相的机械强度和色谱仪系统耐压性能的限制。然而，只要使用很小粒度的固定相，只有当达到最佳线速度时，它具有的高柱效和快速分离的特点才能显现出来。
   
因此要实理超高效液相色谙分析，除必须制备出装填Δp＜2μm固定相的色谱柱外。还必须提供高压溶剂输送单元、低死体积的色谱系统、快速的检测器、快速自动进样器以及高速数据采集、控制系统等。上述这几个单独领域最新成果的组合，才促成超高效液相色谱的实现。

二、实现超离效液相色谱的必要条件
    UPLC的实现表明液相色谱已进人超越HPLC的崭新时代。它使液相色谱的分离效率和分离速度在性能上达到了新的高度，这是依靠Waters公司在以下几个方面取得的技术进展。

1.高柱效的ACQUITY UPLC色谱柱                           
应用“杂化颗粒技术”（hybrid particle technology，HPT）合成了新型全多孔球形1.7μm反相固定相，并制备了高柱效的ACQUITY UPLC色谱柱。

UPLC系统的心脏是色谱柱，为实现UPLC潜在的分离度、分离速度和灵敏度，必须制造出耐高压的反相填料，以充分显现UPLC的全新特性。

Waters公司在1999年使用制备硅胶反相整体柱的原料四乙氧基硅烷（TEOS），利用“杂交颗粒技术”与1/3的甲基三乙氧基硅烷（MTEOS）进行杂化交联，合成了全多孔球形2.5μm、3.5μm、5μm、7μm，孔径12.5nm的HPLC的反相填料——XTerra。由于甲基基团存在于基体杂化颗粒的表面和内部，使其化学稳定性大为增强，适用pH值范围达2～12，进行的交联反应为:


反应后生成的有机-无机杂化颗粒－甲基聚乙氧基硅胶全多孔球形填料。其经十八烷基三氯硅烷表面而改性和三甲基硅烷封尾后，制成商品牌号为XTerra的反相固定相，它出现后迅速获得广泛应用，其基体立体结构如图7-16所示。

2003年Wyndham等仍使用杂化颗粒技术（HPT），将TEOS于1/5双（三乙氧基硅）乙烷（BTEE）进行杂化交联，合成了全多孔球形5μm，孔径约15nm的有机－无机杂化颗粒(SiO2)(O1.5Si-CH2-CH2SiO1.5)0.25，再经十八烷基三氯硅烷表面改性和三氯甲基氯硅烷封尾后，制成反相固定相。由于基体颗粒内乙基基团构成桥式交联，使颗粒具有更高的化学稳定性，其机构强度也有了极显著的提高。Waters公司在上述工作的基础上制成了全多孔球形1.7μm的UPLC反相固定相，它保持与传统HPLC固定相的孔径和孔体积，成为商品号为AQUITY UPLCTM新型固定相，其基体进行的交联反应如下：


反应后生成桥式乙基聚乙氧基硅胶全多孔球形填料。AQUITY UPLCTM基体的立体结构如图7-17所示。

当合成出耐离压并能在广泛pH值范围使用的新型固定相后，还要进行颗粒的筛选，以获取粒径分布尽可能窄的填料。如在HPLC使用的5μm颗粒填料中，其粒径分布一般较宽。会含有大量的4μm以下和6μm以上的粒子，填充后会造成柱效的损失。Waters公司开发的筛分技术。可以大批量生产1.7μm粒径分布很窄的高质量填料。
   
最后要将高质量的填料装填进2.1mm×100mm的色谱柱.即使柱筛板能堵住1.7μm小颗粒不外流，又不至于引起柱压的大辐升高，还能获得达20万块/m理论塔板数高柱效的色谱柱。Waters公司新设计的装填技术，使用了全新筛板，柱管和连接件，在超过140MPa(20000psi)压力下装填，产生了更稳定的柱床，保AQUITY UPLC色谱柱的高柱效和长寿命。
   
为加强可迫溯性，在每根AQUITY UPLCTMC18(ф2.1mm×100mm)色谱柱都装备一个称为eCordTM的装置，它可记录色谱柱的进样次数，最大反压及温度，还包括该色谱柱独特的分析证书(certificate of analysis)。

2.超高效液相色谱的输液泵
    制造超高压输液泵除了实现密封和提供高压驱动力外。还需解决在超高压下。溶剂的可压缩性及绝热升温问题。
 
Waters公司为AQUITY UPLCTM色谱柱装备了一台用独立柱塞驱动，可进行4种溶剂切换的二元高压梯度泵，对柱长10cm、填充1.7μm固定相的色谱柱，其达到最佳柱效时的1.0mL/min流速，耐高压可达105MPa（15000psi）。在此压力下，溶剂尤其是梯度分离时使用的混合溶剂，其压缩性会有显著变化，因此溶剂输送系统可在很宽压力范围内，具有补偿溶剂压缩性变化的能力，从而能在等度或梯度分离条件下保持流速的稳定性和操度的重现性。此外，经过集成改进的真空脱气技术，可使4种流动相溶剂得到良好的脱气。
   
在普通HPLC:的高压梯度系统，在起始3％（0％～3％）和最后3％（97％～100％）时的梯度混合性能较差。AQUITY UPLCTM的超高压输液泵，梯度性能极佳，当梯度陡度为1％，梯度范围为100％～90％.时，获得的梯度运行由线如图7-18所示。

图7-19为用UPLC梯度分析乙酰替苯胺、烷基芳酮混合物时，保留时间得重现性。其精确、可靠的梯度性能与HPLC的重现性不相上下。


3.超高压液相色谱的高速检测器
UPLC色谱柱使用1.7μm固定相，分离获得的色谱峰半蜂宽小于1s，这就对UPLC的检测器提出了挑战。首先当色借峰通过检测器时，它必须有一个非常高的采样速度和非常小的时间常数，使它能收集足够的数据点、以获得准确、可重现的保留时间和峰面积。其次检测器的流通池死体积要尽叮能小，减少谱带扩展以保持高柱效。最后检侧器的光学通道要提供能满足UPLC高灵敏度检测要求。

AQUITY UPLC使用采样速度达40点/s，池体积仅为500mL（约为HPLC池体积的1/20）的新型光导纤维传导得流通池，当光束通过光导纤维进入流通池后，利用聚四氟乙烯池壁的全析射特征，不损失光能最，而使检测灵敏度比HPLC增加2～3倍。光源可使用可变波长的紫外光或二极管阵列系统。

4.低扩散、低交叉污染的自动进样器
在UPLC中进样系统也是非常关键的因素，传统的HPLC使用的手动或自动进样阀。都不是为极端高压情况下设计的。在UPLC中为保护色谱柱不受极端高庄力波动的影啊，进样过程应当相对无压方波动，进样系统的死体积必须足够小，以降低样品谱带的扩展。快速进样周期可使UPLC在具有高样品容量的同时也实现高速度，并使无人照管，长时间运行的自动进样得以实现，还具有极低交叉污染的小体积进样能力。

在AQUITY UPLC中为降低死体积，减少交叉污染。其自动化进样器的设计使用了下述新技术：
 
①针内针进样探头（XYZZ）为高速进样机械装里，可快速进样。针内针的含义是使用液相色谱管路（PEEK材料）充当进样针以减少死体积，而“外针”是一小段硬管，用来扎破样品瓶盖。
   
②压力辅助进徉。为了降低进样时的交叉污染，采用一强、一弱的双溶剂的进样针清洗步骤，这两种洗针溶剂需同时得到良好的脱气。此技术可保证可靠、重现的进样。

③在自动进样器内，可安置96位或384位样品盘。每个位置可放置2或4mL样品瓶。新型的样品组织器可接受21个样品盘的编程。

5.优化系统综合性能的整体设计
Waters AQUITY UPLC系统的总体设计有以下特点：
①UPLC仪器各部件连接管线接头等整体系统的死体积远低于常规HPLC系统、实现优化的超低死体积和系统体积。
②新型高压输液单元为小颗粒杂化填料柱提供了最优化的流速。
③最优化的高速检测器的创新设计，实现了样品的高灵敏度检测。
④新型的自动进样器、实现了快速进样、配合专用样品组织器，增大了10倍样品容量。
⑤MassLynxTM和EmpowerTM两种软件平台，可以完全控制此套创新设备。

由于使用了优化的总体设计，AQUITY UPLC系统实现了样品的高效、快速分析。使样品的分析时间仅为HPLC的1/6。而检测灵敏度却至少提高了3倍。图7-20为对同一样品，使用HPLC和UPLC进行分析获得的谱图。由谱图比较可明显看到UPLC在解决组成复杂样品分析的优越性，它具有的高效、快速和高灵敏度，可大大提高分析工作效率。

附件中是上述的PDF文档：
超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相色谱[/url]

下面提供几篇相关的参考文献：
这是两篇中文的文献： http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20061119/633587/

这是三篇英文的文献（PDF格式）：
UPLC英文