主题：【资料】电镜常用包埋剂及配方

常用包埋剂及配方
目前在电镜技术上使用的包埋剂种类颇多，但普遍使用的是环氧树脂，在免疫和细胞化学技术中还会使用到丙烯酸树脂。

环氧树脂（epoxy resin）
环氧树脂是一类具有末端环氧基的甘油多聚酯。它的分子中有两种反应基团，即环氧基团（epoxide group）和氢氧基团（hydroxyl group）。其末端基团易与含有活性氢原子的化合物如胺类（如DMP-30，DMAE，乙二胺等，又称催化剂或加速剂）反应，使单体首尾相连接形成长链聚合物。此外，在单体中的氢氧基团能与有机酸酐（如MNA，DDSA，九烷基琥珀酸酐，NSA等，又称硬化剂或固化剂）结合，使单体分子形成横桥。所以，环氧树脂以单体渗入细胞组织，而这种单体在一定的温度条件下，在硬化剂和加速剂作用下，就形成一个非常耐溶剂和耐化学腐蚀的交链稳定的三维空间聚合体。为了改善聚合体（包埋块）的切割性能，还会在环氧树脂包埋配方中加入增塑剂，以调节包埋块的韧性。

环氧树脂包埋剂对细胞微细结构有较好的保存性能，聚合后体积缩小较少，而且在真空中能经受较长时间的轰击。但它的操作不太方便，反差较弱。

环氧树脂的型号较多，常用Epon812，Spurr树脂（ERL-4206）等，现介绍最常用的两种环氧树脂

Epon812包埋剂

Epon812是一种进口树脂，它是一种长链的脂肪族环氧化合物，是目前国际上普遍采用的一种优良包埋剂，粘度为150-210cP。该包埋剂的配制方法甚多，但一般都按1961年Luft提出的配方进行。其配方如下：
A液：Epon812 62ml
      DDSA    100ml
B液：Epon812  100ml
      MNA      89ml
上述配方若改变A液和B液的比例则可调节聚合块硬度，A液多则软，B液多则硬。通常冬天使用$A:B=2:8$；夏天使用$A:B=1:9$，可视组织的硬度和气候不同选择其比例。配制时可先分别配制A液和B液，然后将A液和B液按一定比例混合后，再加入$1\%-2\%$的加速剂，边加边搅拌，使其充分混合。为了方便操作，也有人将Epon812，DDSA，MNA三种成分按一定比例直接混合使用。Epon812的聚合温度为：37℃过夜，60℃24-36小时。

根据南方地区的气候条件，可用下列配方：
Epon812 51ml
DDSA    12ml
MNA    37ml
DMP-30  1.8-2ml
聚合条件&室温过夜，60℃8-12h

DDSA是十二烷基琥珀酸酐（Dodecenylsuccinic anhydride）的简称。它是一种可得到软性包埋块的长链脂肪族分子。

MNA是甲基内次甲基二甲酸酐（Methyl Nadic anhydride）的简称，又称六甲酸酐，它有两个链环，能获得较硬的包埋块。

DMP-30是2，4，6-三（二甲基氨基甲基）苯酚（2，4，6-Tris（dimethylaminomethyl）phenol）的简称。它能加速固化过程。

Spurr树脂（ERL-4206包埋剂）

这是1969年由Spurr推荐使用的包埋剂，所以也称Spurr树脂。它含有两个环氧基，是一种低粘度的环氧树脂。由于具有粘度低的特点，所以近年来一些实验室已开始使用它。其配方可按下表中各种成分的比例，即可获得不同性能的包埋块。其配方如下：

Spurr树脂包埋剂配方 成分（g）标准硬度 硬 软 快速聚合配方 缓慢聚合配方 
VCD 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 
DER-736 6.0 4.0 7.0 6.0 6.0 
NSA 26.0 26.0 26.0 26.0 26.0 
DMAE 0.4 0.4 0.4 1.0 0.2 
聚合时间70℃（h） 8 8 8 3 16 
混合时间（天） 3-4 3-4 3-4 2 7 

VCD是二氧化乙烯环己烯（vinylcyclohexene dioxide）的简称。它的分子小，粘度低，聚合块硬度大。

DER-736是diglycidyl ether of a polypropylene glycol的简称。它属于脂肪族，分子小，有低粘度性质，可调节包埋块的硬度。

NSA是nonenylsuccinic anhydride的简称。它是一种特殊的硬化剂，应避免暴露在潮湿的大气中，以防环氧或酐链的水解作用。

DMAE是dimethylaminoethanol的简称。它是催化剂，增加催化剂的比例，可以缩短聚合的时间。

Spurr树脂最终硬度可用DER-736的量来调节。配制时，先把前三种成分混合后，最后才加入DMAE，但从开始到混合完成，达到淡黄色状态需3-7天。此包埋剂在$70\,^{\circ}\mathrm{C}$，一般8小时即可完全聚合，用陈旧的包埋剂时，则聚合时间会减少。因Spurr树脂嗜氧，聚合时不要加盖。包埋剂最好是用新鲜配制，但为了方便，可预先配制好保存在低温和防潮的环境中。Spurr树脂与Epon812树脂相比粘度低，操作方便，但毒性比Epon812树脂大，所以操作时要更加小心，此外，Spurr树脂各成分间的分子量大小差异较大，在组织中的渗透速度不一，容易个别成分造成渗透不均，而导致局部聚合不完全，染色效果不佳。

丙烯酸树脂（acrylic resin）

丙烯酸树脂无色透明的，由丙烯酸衍生物聚合而成。丙烯酸单体粘度低，可以在低温下渗透及聚合，因而能满足免疫和细胞化学技术低温操作的要求。其聚合方式有两种，热聚合和紫外线照射聚合。但它对脂类等成分的抽提比环氧树脂严重，为此它也需要在较低的温度下使用才可能减少抽提作用。此外，聚合前后丙烯酸树脂的体积变化较环氧树脂大（体积大约收缩$10-20\%$），并且它在电子束的照射下稳定性比环氧树脂低，放热的聚合过程可引起组织细胞结构的损伤，致敏性也比环氧树脂强，使用时要小心防护。一般来说，除了免疫和细胞化学技术外，超微结构的研究并不推荐使用它。在电镜中使用较多的丙烯酸树脂有伦敦白胶（LR White）和Lowicryl系 列的树脂。

伦敦白胶（LR White）

伦敦白胶含有7种不同的丙烯酸单体和2种增塑剂，引发剂是BPO（dibenzoyl peroxide），加速剂为N，N-dimethyl paratoluidine，但具体的配方和成分没有报道。它的粘度低，渗透能力强，可用于较大的组织块或致密的组织，由于它有一定的亲水性，方便水性染料进入，染色效果佳，使用非常方便，通常买回来的是已经混合好的试剂，它的有效期仅为12个月。伦敦白胶可以微溶于水，因而可以采用部分脱水方案，但不能使用丙酮作为脱水剂。氧气会抑制聚合反应的进行，因而聚合时要在模块中注满包埋剂并盖紧盖子。为了方便运输和储存，也有未加BPO的伦敦白胶（uncatalysed LR White）出售，这种试剂需要加入催化剂（9.9g催化剂/500gLR White）充分搅拌并室温放置24小时以上才能使用。
Lowicryl系列包埋剂

Lowicryl系列包埋剂是专为低温包埋设计的包埋剂。它有两种类型：一种是极性树脂，K4M和K11M；另一种是非极性树脂，HM20和HM23。极性树脂亲水，使样品保存在一个水性的环境中从而较少蛋白质变性，且染色的效果较好。而非极性树脂的切割性能比较好。两种树脂通常都在隔绝氧气的情况下低温紫外线照射聚合。Lowicryl系列包埋剂全部以试剂盒的形式出售，有详细的说明书提供参考。