主题：【原创】CNAS认可实验室标准菌株管理作业指导书

1. 目的

规范微生物实验室用于实验质量控制和操作评估的标准菌株的管理与使用，保障实验结果可靠及人员和环境安全。

2. 适用范围

适用于微生物实验室所有标准菌株的管理与使用。

3. 职责

3.1 微生物实验室负责人负责组织标准菌株的采购、溯源，并对标准菌株的使用进行监督和管理。
3.2 微生物室检验人员严格按照本规程要求转种、保存、保管、使用和弃置标准菌株。
4.  工作程序
微生物实验室保存有满足试验需要的标准菌株，目前仅限于三类、四类致病菌，即一般和低致病性细菌，不包括病毒、螺旋体、衣原体、立克次体和真菌等标准菌株。保存的标准菌株主要用于各类培养基、检检测剂的性能检测和质量控制。
4.1 标准菌株来源
4.1.1直接从通过认可的微生物标准菌株保藏机构购入。每批标准菌株必须附带有供应商的合格证或检测报告或说明书，证明所采购的标准菌株是合格的。
4.1.2标准菌株也可采用其他可追溯到认可标准菌株保藏机构的途径获得。
4.2 标准菌株的保管
4.2.1实验室标准菌株保存于P2实验室专用的标准菌株保存冰箱。
4.2.2标准菌株保管员及科室负责人双人双锁负责保管标准菌株。
4.2.3标准菌株应按规定的时间定期转种，一般每转种2代做一次鉴定，如发现污染或变异应及时处理。
4.2.4保管人员工作变动时应作好交接工作。
4.3 标准菌株的使用和保存
4.3.1标准菌株的类别
实验室内的标准标准菌株根据用途不同，分为储存标准菌株、传代用标准菌株和工作用标准菌株。
a. 储存标准菌株：以冷冻干燥保藏为主，用于标准菌株的长期保存，一般是从标准菌株保藏中心或专业实验室购买得到的标准菌株。一般可保存3～5年。
b. 传代用标准菌株：采用磁珠冻存管保藏或液体石蜡覆盖保藏，用于标准菌株的传代。磁珠冻存管保藏一般可保存2年；液体石蜡覆盖保藏一般可保存3～6个月。
c. 工作标准菌株：保存于琼脂斜面培养基中，作为工作用标准菌株。一般可保存1～2个月。
4.3.2标准菌株的接收
实验室收到标准菌株，首先应进行符合性感官检查，记录菌株号和标准菌株来源途径信息，确保溯源性清楚。同时还应记录标准菌株名称和数量、生产日期、接收日期和有无破损等情况。
4.3.3冷冻干燥标准菌株的恢复培养
    从标准菌株保藏中心购买的冻干标准菌株为第F0代。按标准菌株保藏中心的要求进行恢复培养。标准菌株活化前，将安瓿管保存在5-10℃的环境下。
方法一：无菌操作，去除菌株包装物，将菌移入营养肉汤，置建议温度下增菌18～24小时，挑一环划营养琼脂平板作为工作菌株使用，其余的肉汤直接放保种磁珠加甘油，放低温冰箱-70℃冻存做为储存菌株，此为第1代。
方法二：用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰将安瓿管顶端加热，滴无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂，用锉刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。用无菌吸管，吸取0.3-0.4ml适宜的液体培养基（如营养肉汤），滴入安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，取约0.2ml菌体悬浮液，移植于指定的琼脂斜平板培养基上，剩余的菌液，注入指定的液体培养基内（3-4ml），然后在建议的温度下培养18～24h，均为第1代。
对自带培养液的ATCC菌株，可在无菌条件下捏碎安瓿管顶端，让培养液自行流入塑料管内，置36℃放置一会，使标准菌株完全溶解于培养基中，用接种环划营养琼脂平板，在建议的温度下培养18～24h，此为第1代。
某些标准菌株经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长。
4.3.4标准菌株的传代
标准菌株传代一般不超过5代,从标准菌株保存中心获得的冷冻干燥标准菌株为第0代。
a. 冻干标准菌株在液体培养基内溶解，再转种至平板培养基上得到单个纯菌落，此为第1代，挑取平板上纯菌落到磁珠冻存管，作为第1代传用标准菌株。或者，冻干标准菌株在液体培养基内复壮后直接加磁珠甘油保存，作为第1代传代用标准菌株。如有必要，可在复壮后转种平板或TSB，再挑取菌落或肉汤培养物，加入磁珠冻存管保存，此为第2代传代用标准菌株。
b. 在保留传代标准菌株的同时，挑取纯菌落转接斜面，此标准菌株作为工作用标准菌株，为第2代或第3代。
c. 将传代用标准菌株管冷冻保存（-70℃以下），将第2代或第3代工作用标准菌株以适当温度下培养适当时间后可用于实验。某些标准菌株需经2-3代培养后才能恢复其生化特性，建议用第3代以后菌株作为工作菌株。
d. 取一支冷冻保存的第1或第2代传代用标准菌株转种于平板和斜面培养基上，平板上的
标准菌株转入磁珠冻存管，为第2代或第3代传代用标准菌株；斜面培养基经适当温度下培养适当时间后可用作第3代或第4代工作用标准菌株。
e. 当工作用标准菌株代数小于5时，可直接用上一代工作用标准菌株转接下一代工作用标准菌株。
f. 按上述程序操作，直至第4代传代菌株全部转种为第5代工作菌株为止，重新购入标准菌株，重复上述操作程序保藏和使用标准菌株。
4.3.5标准菌株的保存方法
4.3.5.1 磁珠低温保存法
磁珠低温保存法适用于保存传代用标准菌株，一般可保存2年。
用接种环挑取经18-24小时纯培养的菌落，接种到冻存管中的液体保存剂中，充分研磨。盖好瓶盖并颠倒4-5 次，让菌株吸附于磁珠上，注意不要剧烈振荡。静置15分钟后用移液枪尽量吸走冻存管内的液体，使磁珠保持干爽。盖上瓶盖，做好标记，置-70℃下保存。
4.3.5.2甘油冷冻管保存法
甘油冷冻管保存法适用于保存传代用标准菌株，一般可保存2年。
a. 将待保存用标准菌株接种至平板或琼脂斜面，经37℃24～48h培养后，用无菌接种环轻轻刮取菌苔，移至预先装有试管的无菌蒸馏水中，调整菌液浓度，使其等同于麦氏比浊管第10号管。
b. 向已制备好的菌悬液中加入等体积，浓度为20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。
c. 轻轻振摇，使10%甘油菌悬液充分混合，分装于无菌小试管中，在-30℃条件下保存。
4.3.5.3液体石蜡覆盖保存法
液体石蜡覆盖保藏法适用于保存传代用标准菌株，一般可保存3-6个月。
a. 取纯化标准菌株穿刺接种于半固体培养基中，经37℃18～24h培养后，加无菌液体石蜡覆盖半固体表面（高度1厘米为宜）。
b. 石蜡油封存以后，放入4℃冰箱中保存，也可直接放在低温干燥处保存。
c. 肠道细菌、葡萄球菌一般可保存3-6个月；保存O1群和非O1群霍乱弧菌时宜放置室温阴暗处；保存副溶血性弧菌时，用含3.5%氯化钠半固体，宜放置室温阴暗处；保存葡萄球菌、链球菌可用10%血半固体。
4.3.5.4斜面低温保存法
斜面低温保存法适用于保存工作用标准菌株，一般可保存1～2个月。
取纯化标准菌株转接种于适宜的固体斜面培养基上，经37℃18～24℃培养后，用封口膜将试管塞部分包扎好，放4℃冰箱中保存。
4.3.6 标准菌株的使用
4.3.6.1 内部质量控制：用于阳性对照、培养基的技术性验收、人员培训、方法确认/证实等。
4.3.6.2 外部质量控制：用于能力验证、实验室比对。
4.4标准菌株实验室编号规则
4.4.1 标准菌株名称使用中文简称，如“副溶血性弧菌”用“副溶”表示；“金黄色葡萄球菌”用“金葡”表示；“奇异变形杆菌”用“奇变”表示。
4.4.2 标准标准菌株编号规则：简称+菌号+传代次数-制备管数，另需标注传代日期。例如：福氏志贺氏菌ATCC12022第2代共3管分别用志贺ATCC12022-0201  20140306、志贺ATCC12022-0202  20140306、志贺ATCC12022-0203 20140306表示。
4.4.3 实验室从样本中分离得到的标准菌株编号规则：简称+菌号+传代次数-制备管数，菌株号用SFH+序号表示，例如实验室分离的福氏志贺氏菌于2014年6月3日传5代1管，用志贺SFH01-0501 20140603表示。
4.5 标准菌株期间核查
4.5.1 期间核查的频率：每年对常用的标准菌株进行一次期间核查。
4.5.2 工作菌株期间核查的方法及依据：同工作菌株的确认。
4.5.3建立标准菌株期间核查记录。
4.6 标准菌株的废弃
4.6.1 废弃标准菌株先用高压蒸汽灭菌：121℃，30分钟，然后委托有资质的单位处理。
4.6.2 下列标准菌株需及时销毁处理：发生污染或变异的标准菌株；超过保存期限的标准菌株；使用后的标准菌株。
4.7 记录：实验室应记录标准菌株的配制、复活、传代、确认等工作内容并定期交文档管理员存档。