主题：【原创】听说水中微生物检测可能又要增加一个检测方法（大肠菌群和埃希氏菌的测定）－酶底物法

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新《生活饮用水卫生标准》GB5749- 项目解读（2）

大肠埃希氏菌
一、大肠菌群与埃氏菌属
大肠菌群：包括肠杆菌科的埃氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属，这些细菌均来自人和温血动物的肠道，需氧与兼性厌氧，在37℃能分解乳糖产酸产气，以革兰氏阴性杆菌为多。目前该项指标已被广泛应用于食品生产中卫生质量方面的指标菌，其数量是采用相当于100g或100ml食品中的可能数来表示，或称大肠菌群最近似数(Maximun Probable Number,MPN)。大肠菌数的高低，表明粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。
二、埃希氏菌属
中文学名
埃希氏菌属 
拉丁学名
(Escherichia Castellani and Chalmers,1919) 
形态描述
直杆状，1.1～1.5μm×2.0～6.0μ m，单个或成对。许多菌株有荚膜和微荚膜。革兰氏阴性。以周生鞭毛运动或不运动。兼性厌氧，具有呼吸和发酵两种代谢类型。此描述仍局限于大肠埃希氏菌(E.coli)，因为蟑螂埃希氏菌(E.blattae)没有很好的研究，并仅有少数菌株。最适温度37℃。在营养琼脂上的菌落可能是光滑(S)、低凸、湿润、灰色、表面有光泽、全缘，在生理盐水中容易分散；菌落也可能是粗糙(R)、干燥、在生理盐水中难于分散。在这两种极端类型之间有中间型。也出现不粘和产粘液类型。化能有机营养。氧化酶阴性，乙酸盐可作为惟一碳源利用，但不能利用柠檬酸盐。发酵葡萄糖和其他糖类产生丙酮酸，再进一步转化为乳酸、乙酸和甲酸，甲酸部分可被甲酸脱氢酶分解为等量的CO2和H2。有的菌株是厌氧的，绝大多数菌株发酵乳糖，但也可以延迟或不发酵。出现在温血动物肠的下部，蟑螂肠道的下部。
DNA的G+C mol％是48～52(Tm)。种间鉴别见表3-5。
模式种：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。 
三、致病性大肠埃希氏菌
大肠埃希氏菌在人和动物的粪便中大量存在，其中有少数几种能引起人类食物中毒。根据致病性的不同，致泻性大肠埃希氏菌被分为产肠毒素性、侵袭性、致病性、黏附性和出血性5种。部分埃希氏菌株与婴儿腹泻有关，并可引起成人腹泻或食物中毒的暴发。大肠埃希氏菌O157:H7是导致1996年日本食物中毒的暴发的罪魁祸首，它是出血性大肠埃希氏菌中的致病性血清型，主要侵犯小肠远端和结肠。常见中毒食品为各类熟肉制品、冷荤、牛肉、生牛奶，其次为蛋及蛋制品、乳酪及蔬菜、水果、饮料等食品。中毒原因主要是受污染的食品食用前未经彻底加热。
四、详解
五、埃希氏大肠菌及检验
a、定义：
　　大肠埃希氏菌更习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，并且大肠杆菌株ATCC 11775是该属的模式菌种。大肠杆菌的不同菌株间DNA相关性为80%，而与同科的志贺氏菌属（除鲍氏志贺氏菌外）的DNA相关性可达80-87%。与人类疾病有关的大肠杆菌，统称为致泻性大肠杆菌（此名称不易与致病性大肠杆菌相混淆），一般包括五种：即肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）和粘附性大肠杆菌（EAEC）。文献报道还有几种，象：凝集性大肠杆菌、即产VT毒素又具有侵袭性的大肠杆菌等，但目前尚未达成统一共识。
b、生物学特性：
基本形态特征：
　　此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般大小约0.5μ-0.8μm*1.0μm-3.0μm,因生长条件不同，个别菌体可呈近似球状或长丝状。此菌多单独存在或成双，但不呈长链状排列。约有50%左右的菌株具有周生鞭毛而能运动，但多数菌体只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱；多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数量多的菌毛，有的菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽胞，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。
培养特征：
　　由于此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：（1）光滑型： 菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散。（2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易在生理盐水中自凝。（3）粘液型：常为含有荚膜的菌株。此菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为6.8-8.0，所用培养基pH为7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于8.0则生长缓慢。
生化反应与血清学反应
　　大肠杆菌属于卫生学意义的大肠菌群和粪大肠菌群的范畴，因此，必须符合大肠菌群和粪大肠菌群的有关定义，在检测大肠菌群、粪大肠菌群的基础上，可以应用I（吲哚）、M（甲基红）、Vi（3羟基-2-丁酮）、C（柠檬酸）即IMViC生化试验对大肠杆菌作进一步鉴定，其IMViC结果为++--或-+--。生化反应是鉴定大肠杆菌的主要方法之一，然而，大肠杆菌之间生化反应的差异非常常见，象：许多菌种非/迟发酵乳糖，但并不说明它们遗传上有明显不同，生化反应非典型的大肠杆菌菌株与典型菌株的DNA相关性在85%-100%。附表1为大肠杆菌生化反应特性表。其中H2S、脲酶、阿糖酸、吲哚、ONPG试验常为首选生化反应，其余为进一步的生化试验。大肠杆菌在赖氨酸脱羧酶、粘质酸盐、醋酸盐生化试验中，有一项或多项试验阳性，且厌氧性生长弱，有动力和吲哚试验阳性可与志贺氏菌相鉴别。
　　大肠杆菌的血清学反应，往往是对经分离、鉴定、确证为大肠杆菌的 进一步分型，常不作为常规方法使用。附表2所列主要致泻性大肠杆菌的血清型。对大肠杆菌的分型鉴定工作，基层检验单位若有要求时，可与各地所属出入境检验检疫局实验室联系，委托进行血清学鉴定工作。
c、大肠杆菌的抵抗力：
　　此菌对理化因素的抵抗力，在无芽胞菌中是最强的一种，在室温可存活数周，在土壤、水中存活数月，耐寒力强，但是在30分钟内快速冷冻，将37℃降至4℃的过程，可杀死此菌。加热60℃，30分钟，此菌可灭活。对漂白粉，酚、甲醛等较敏感，水中1ppb氯可杀死此菌。此菌耐胆盐，在一定程度上能抵抗煌绿等染料的抑菌作用，在选择性培养基配制上，常利用此菌这一性质。
d、卫生学意义与流行学
　　由于大肠杆菌是人及各种动物肠道中的正常寄居菌，常随粪便从人及动物体排出，广泛散播于自然界，所以一旦检出大肠杆菌，即意味着直接或间接地被粪便污染，而在卫生学上被用于饮水，牛奶或食品等的粪源性污染卫生细菌学指标；并且由于大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道病原菌相近，它的出现也可能预示着某些肠道病原菌（例：沙门氏菌、志贺氏菌）的存在，因此该细菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。
　　致泻性大肠杆菌是引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病，其中尤以EPEC、ETEC所占比例为大。附表3是我国部分省市主要腹泻病原体检出率情况，尽管目前报道各地主要腹泻病是由志贺氏菌或轮状病毒引起的，但是，多年来，致泻性大肠杆菌引起的腹泻病例始终位于第二位，可见大肠杆菌肠道传染的广泛性。还有，致泻性大肠杆菌亦可常年引发人体腹泻，以夏秋季为高峰，在患者感染住院率中，婴幼儿占60%以上。近来，EHEC O157：H7为世界卫生组织（WHO）定为新的食源性致病菌，其引发的出血性肠炎的暴发或散发病例，自1983年以来在北美州（美国、加拿大）地区逐年增多，英国、日本亦有爆发和散发病例报道，我国也发现散发病例，尚未有爆发EHEC的报道。附表4为近几年EHEC的污染状况。e、大肠杆菌检验程序图解：
检 样

LST肉汤

↓37℃，48h

LST肉汤管阳性 （疑似大肠菌群）↓37℃，48h　　
EC肉汤　　　　 BGLB肉汤管阳性 （证实大肠菌群）
↓44℃，24h　 　按BGLB肉汤产气管数，查MPN表，报告大肠菌群MPN/g
EC肉汤产气管为阳性（粪大肠菌群）查MPN表，报告粪大肠菌群MPN/g 阳性管再培养24hEMB平板分离↓ 37℃，24h黑色菌落移种营养琼脂斜面
　
LST肉汤 　　　IMViC生化试验　　　　 革兰氏染色
产酸产气　　　 ++--/-+-- 　　　　　无芽胞G-杆菌
大肠杆菌

按EC肉汤产气管数，查MPN表，报告大肠杆菌MPN/g

说明：

1、由于大部分致泻性大肠杆菌在6℃条件中可失去活力，故大肠杆菌的定性检测比定量检测更适宜。如果确有大肠杆菌定量检测要求的话，可用MPN法或终点稀释法进行。

2、基层单位如有大肠杆菌生化鉴定要求或大肠杆菌血清学分型要求，可委托属地出入境检验检疫局进行检验。

3、检测大肠杆菌的MUG法和膜过滤法，可参阅有关标准说明进行。

4、国标法与FDA方法，在所用培养基、检验程序上略有差异，但不影响大肠杆菌检验结果的准确性。本章介绍的方法，可详见SN 0169-92标准。

致病性大肠埃希氏菌及其检验
致病性大肠埃希氏菌是指能使人、动物(尤其是婴儿和幼龄动物)感染及人食物中毒的一群大肠杆菌。在自然界中本菌分布广泛，主要寄居场所是人和其它温血动物的肠道中，是一类条件性致病菌。致病性大肠埃希氏菌的形态特点、培养特性和生化特性均与非致病性大肠埃希氏菌非常相似，以至难以区分，只能通过血清学的方法，从抗原结构的差异来区别。在致病性大肠埃希氏菌中，有些血清型能够引起人的食物中毒，有些血清型能够引起人的肠道内外感染。还有一些血清型的菌株能够使畜禽发病，危害畜牧业，降低畜产食品的质量。致病性大肠埃希氏菌可从饮用水，未消毒牛乳，病畜脏器、禽类及其人畜粪便污染的各种食品中分离出来。致病性大肠埃希氏菌属主要分为五大类，首先根据发病机理分为三大类，
1、产毒素型大肠埃希氏菌(ETEC)，2、侵袭型大肠埃希氏菌(EIEC)3、肠道致病性大肠埃希氏菌(EPEC)近来又提出另外两类4、即出血性大肠埃希氏菌(EHEC)5、肠粘附性大肠埃希氏菌(EAEC)但是，致病性大肠埃希氏菌的致病性是一个很复杂的问题，也并非由某一方面的因素所决定。
致病性大肠埃希氏菌中，一般认为能产生耐热{ST)和不耐热(LT)肠毒素的两种菌株均可引起人的食物中毒。引起大肠埃希氏菌币毒的主要是一些动物性食品，如乳与乳制品、肉类、水产品等，牛和猪是传播这种病菌、引起中毒的主要原因。
1996年7月在日本就发生了大肠杆菌0157型引起的食物中毒，造成9017多人中毒，10人死亡，其原因与生食萝卜苗有关，其中92例并发出血性肠炎及出血性尿毒症。2001年，再江苏、安徽等地爆发的肠出血性大肠杆菌0157:H7食物中毒，造成177人死亡，中毒人数超过2万人。
如仔猪黄、白痢、猪水肿病、牛腹泻和败血症等均可由大肠杆菌引起。
一、生物学特性
1．形态与染色特性
菌体两端钝圆、中等大小，杆状(有时呈卵圆形)、1—3um X 0.6um、周生鞭毛，能运动，不产生荚膜，革兰氏阴性，而且一般是对碱性染料着色较好，但有时两端着色较浓，要与巴氏杆菌区分开来。
2．培养特性
1)需氧及兼性厌氧菌
2)对营养的要求不高，在普通琼脂上就生长良好，在15C-45℃范围内均可生长，但最适生长温度为37℃，最适pH为7.2—7.4。
3)在普通琼脂平板上培养24小时，可形成圆形、凸起、光滑、湿润、半透明、边缘整齐、中等大小的菌落．其菌落与沙门氏菌比较相似，但是，大肠杆菌菌落对光(45角折射)观察可见荧光。
4)在肉汤培养基中生长18～24小时变为均匀浑，而后底部出现粘性沉淀物，并伴有臭味。
5）部分菌落可出现β溶血。
6）在远藤琼脂上长成带金属光泽的红色菌落
7）在S．S琼脂平板上多不生长，少数生长的细菌，也因发酵乳糖产酸而形成红色菌落；
8）在伊红美兰琼脂上形成具有金属光泽的黑色菌落
9）在麦康凯琼脂上培养24小时后孤立菌落呈红色

3．生化特性

1）可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，有些不典型的菌株不发酵或迟缓发酵乳糖；

2）不同菌株对蔗糖，卫矛醇、水杨苷发酵结果不一致。

3）本菌可使赖氨酸脱鞍、不能使苯丙氨酸脱羧。

4）不产生H2S，不液化明胶，不分解尿素，

5）、不能在氰化钾培养基上生长，靛基质试验阳性，V-P试验阴性，不利用枸橼酸盐。后四项生化特性是典型的大肠埃希氏菌，与此不一致的即为非典型大肠埃希氏菌菌。

IMViC试验：如IMViC试验为+、+、-、-，且乳糖发酵，表明被检物已有粪便污染，有发生肠道传染病的危险，这是卫生细菌中常用的检测指标。（I：吲哚形成试验，M：甲基红试验，Vi：V-P试验，C：枸橼酸盐利用试验）

4.血清学特性

大肠埃希氏菌的抗原构造主要由菌体抗原(O)，鞭毛抗原(H)和荚膜抗原(K)三部分组成。

1）O抗原

成分为细胞壁上的糖、类脂和蛋白质复合物，也是细菌的内毒素，热稳定性较强，高压蒸汽处理2小时不被破坏。每一血清型只含有一种O抗原，本菌已发现有167种O抗原，分别以阿拉伯数字表示。

2）H抗原

为蛋白质；一种大肠埃希氏菌只有一种H抗原，无鞭毛则无H抗原，H抗原能在80度被破坏，也能被酒精破坏。H抗原共有64种。

3）K抗原

是细胞外部的荚膜或的表面物质，又称包膜抗原。新分离的大肠埃希氏菌70％具有K抗原。根据K抗原耐热的敏感性．可把K抗原分为A、B、L三类，共有103种，致病性大肠埃希氏菌的抗原主要为B抗原，少数为L抗原，B抗原与L抗原均可在煮沸后被破坏，A抗原耐热性强，可耐受煮沸1小时而不被破坏。，

O抗原可将大肠埃希氏菌分成若干血清群，再根据K抗原和H抗原进一步分为若干个血清型或亚型，根据大肠埃希氏菌抗原的鉴定结果，写出其抗原式如O111：K58(B)H12，一般认为H抗原与致病性无关，因此，一般不需要进行H抗原的鉴定。

5．抵抗力

抵抗力中等，各菌型之间存在差异。此菌对青霉素有中等抵抗力，对一般消毒剂都比较敏感。对氯尤为敏感，水中游离氯达到0．2mg／L时，即可杀死此菌。此菌在土壤中、水中及粪便中可存活数月以上。

6．毒素特性

有些大肠埃希氏菌产生肠毒素，

1）不耐热(LT)肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT）：化学成分为蛋白质，分子量较大，60℃ 30分破坏，具有免疫原性，可引起肠道分泌增加，出现腹泻。

（2）、耐热肠毒素（heat-stable enterotoxin，ST）：分子量较小，无抗原性，100℃ 30分钟，仍有活性，可引起肠分泌增加。

二、致病性

致病性大肠埃希氏菌属引起酌食物中毒主要有两种类型，一种是肠道内感染，另一种是肠道外感染，两者具有不同的机理和症状：

1．肠道内感染

1）、肠毒素型大肠杆菌（ETEC）：主要引起腹泻（幼畜或雏鸡），约有40个血清型。肠毒素型菌株进入肠道后主要在小肠内繁殖，不损害肠上皮细胞。繁殖过程中产生肠毒素。

2）、肠致病型大肠杆菌（EPEC）：是引起婴儿腹泻的主要病原菌，该菌不产肠毒素，也无侵袭力，致病机理不清，约有18个血清型。

3）、肠侵袭型大肠杆菌（EIEC）：较少见，该菌不产肠毒素，但侵袭大肠肠壁上皮细胞，引起炎症反应，形成溃疡，约有8个血清型。引起类似痢疾的症状。

2．肠道外感染

三、主要症状

肠道内感染主要造成腹泻与痢疾样疾病；肠道外感染主要引起尿路感染，新生儿脑膜炎、败血症及其他部位的感染。

致病菌引起的食物中毒是感染型和毒素型的综合作用，致病性大肠杆菌引起的食物中毒主要症状为急性肠胃炎，潜伏期为12～24小时，临床出现呕吐、腹泻、发热(体温一般不超过39℃)、头痛、腹痛等，病程一般为1—3天。

四、流行病学特点

1、发病季节 多发生在夏秋季

2、引起中毒的食品种类

与沙门氏菌相同。

3、食品种大肠埃希氏菌的来源

由于大肠杆菌存在于人和动物的肠道中，健康人肠道致病性大肠埃希氏菌率为2—8％，高者达44％，而成人患肠炎、婴儿患腹泻时，致病性大肠埃希氏菌率较健康人高，达29—52％。大肠杆菌随粪便排出而污染水源和土壤，进而直接或间接污染食物。

五、检验

致病性大肠埃希氏菌的检验应按《中华人民共和国国家标准——食品卫生检验方法(微生物学部分)》(GB489．6-84)的有关内容进行检验。其检验程序如图5－2。·

（一）、增菌培养

1、以无菌操作的方法称取样品25g，加入225ml营养肉汤培养基中，可用灭菌砂在研钵中磨碎或以均质器打碎样品。

2、取适量接种于乳糖胆盐培养基中，测定大肠菌群MPN，其余移入500ml三角瓶中于36±1℃培养6小时。挑取一环，接种于一管30ml肠道菌增菌汤中，42℃增菌培养18小时。

（二）、分离培养

1、将乳糖胆盐发酵阳性管液与增菌液分别划线接种于麦康凯或伊红美兰琼脂平板上。

2、于36±1℃培养18—24小时观察菌落

对于污染严重的食品可直接按划线法接种，不经过增菌过程。

（三）、生化试验

1、初筛试验

选取在麦康凯或伊红美兰平板上发酵乳糖或不发酵乳糖的菌落5个以上，分别接种于克氏双糖铁、pH7.2尿素和阿拉伯糖中．经36C培养18～24小时，弃去H2S阳性或尿素酶阳性或阿拉伯糖阴性的培养物。

2、复筛试验

把筛留下的培养物分别接种于缓冲葡萄糖蛋白胨和KCN培养基中，经36+1℃培养48小时，观察生长结果并做V-P试验，弃去V-P阳性及KCN阳性的培养物。

3、证实试验

致病性大肠埃希氏菌属除氧化酶阴性，革兰氏阴性的特征以外，还有以下特性：葡萄糖产酸+，葡萄糖产气+／一，乳糖产酸+90％，柠檬酸盐—，尿素酶一，KCN-，V-P-，动力+或—，阿拉伯糖十，靛基质十95％：可按这些主化特性进一步证实其是否为致病性大肠埃希氏菌属。

（四）血清学试验

1、致病性大肠埃希氏菌血清学试验

假定试验：

从平板上选菌落生长稠密处挑取培养物，用致病性大肠埃希氏菌三种OK多价血清做玻片凝集试验。不凝集的培养物可做阴性报告。

证实试验：

2、侵袭性大肠埃希氏菌血清学试验

在平板上菌落生长稠密处挑取培养物，用侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清做玻片凝集试验，侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清包括两种：OK多价血清和9种OK单价血清：

（五）、产肠毒素大肠埃希氏菌毒素试验

1、动物试验

将经过生化证实试验的大肠埃希氏菌培养物接种肉汤管，于36+1℃培养24小时，3000转／分离心30分钟。取上清液用G6滤器过滤后分作两份，一份加热60℃30分钟，供ST测定用，另一份不加热，供LT测定用。

1）家免结轧回肠段试验：

取体重为2kg的家兔，禁食使肠内容物排空。麻醉后剖腹，取出回肠段，按10～15cm为一段，分段结扎，取一段注射肉汤2mL作为阴性对照，另一段注射已知产毒菌肉汤培养物的上清液2ml作为阳性对照。其他各段分别注射待试菌株肉汤培养物的滤液2mL。将腹壁缝合。

测定LT时，于注射后18小时剖腹检查

测定ST时，于注射后6—8小时剖腹检查

取出肠管分别抽取肠段的积液，测定其容量，并测定肠段的长度。积液量(mL)与肠段长度(cm)之比大于l者为阳性。

2）乳鼠灌胃试验：

2、双向琼脂扩散试验

将被检菌按5点环形接种于Elek氏培养基上，以同样操作共做两份，36±1℃培养48小时，在每株菌的菌苔上各放一片多粘菌素纸片，36+1℃经5—6时，使抗生素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的园并用一滴琼脂垫底。在一份平板的孔内滴加LT抗毒素30ul，另一份平板的孔内滴加ST毒素30ul。放于36+1℃经15～20小时观察结果，在菌斑和抗毒素之间出现白色沉淀带为阳性，无沉淀带者为阴性。

（六）豚鼠角膜试验

供测定侵袭性大肠埃希氏菌用，将经过生化证实试验的待试菌株18—20小时琼脂培养物，用肉汤洗下，使成每lml含菌9亿个菌悬液，作为接种材料。

体重400--500g的健康豚鼠(角膜与结膜外观正常，并经细菌培养检查)的角膜上接种待试菌悬液1滴。

48小时后观察结果，结膜充血浮肿、角膜混浊、眼内充盈泪液或浆液性分物者为阳性，自结膜囊取样分离细菌，鉴定应与原接种菌一致。

（七）、结果报告

根据以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验和豚鼠角膜试验的结果出报告，如果是产毒大肠埃希氏菌时应有肠毒素试验的结果；如果是侵袭性大肠埃希氏荫应有豚鼠角膜试验和血清学试验的结果；如果是肠致病性大肠埃希氏菌时应有血清学试验结果。

中国食品产业网 （2004年11月15日18:20）
           

                1　主题内容与适用范围
            　　本标准规定了应用肠杆菌科噬菌体诊断法检验食品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的基本要求、操作程序和结果判定。
            　　本标准适用于各种食品、食物中毒的检验，也适用于食品从业人员的肠道沙门氏菌和志贺氏菌带菌检验。
            　　2　引用标准
            　　GB 4789.4　食品卫生微生物学检验　沙门氏菌检验
            　　GB 4789.5　食品卫生微生物学检验　志贺氏菌检验
            　　GB 4789.6　食品卫生微生物学检验　致泻大肠埃希氏菌检验
            　　GB 4789.28　食品卫生微生物学检验　染色法、培养基和试剂
            　　3　设备和材料
            　　3.1　温箱：36±1℃。
            　　3.2　水平仪。
            　　3.3　灭菌平皿：90mm×15mm。
            　　3.4　定量滴管：每滴约10μL。用输液用的玻璃接管配4.5号针头，灭菌。
            　　3.5　橡皮乳头。
            　　3.6　灭菌棉签。
            　　3.7　酒精灯。
            　　3.8　接种棒，镍铬丝。
            　　3.9　试管架。
            　　4　培养基和试剂
            　　4.1　营养琼脂、营养肉汤按GB 4789.28中3.7和3.8进行。
            　　4.2　蛋白胨水、靛基质试剂按GB 4789.28中2.13进行。
            　　4.3　三糖铁琼脂按GB 4789.28中3.24和3.25进行。
            　　4.4　肠杆菌科诊断用噬菌体，7种和3种。安瓿启开后用无菌毛细吸管吸出移入灭菌小试管内，用无菌胶塞塞紧，放于4℃冰箱备用。
            　　5　检验程序
            　　5.1　肠杆菌科诊断用噬菌体检验沙门氏菌的程序见图1：
            　　（表略）
            　　5.2　肠杆菌科诊断用噬菌体检验志贺氏菌的程序见图2：
            　　（表略）
            　　5.3　肠杆菌科诊断用噬菌体检验致泻大肠埃希氏菌的程序见图3：
            　　（表略）

6　检验步骤
            　　6.1　前增菌、增菌和分离
            　　6.1.1　沙门氏菌的前增菌、增菌和分离，按GB 4789.4进行。
            　　6.1.2　志贺氏菌的增菌和分离，按GB 4789.5进行。
            　　6.1.3　致泻大肠埃希氏菌的增菌和分离，按GB 4789.6进行。
            　　6.2　噬菌体试验
            　　6.2.1　培养基的准备
            　　营养琼脂平板(含琼脂1%～1.5%，琼脂量视其凝固性而定，约为一般用量的3/4)，每个9cm平皿中约25mL，放在水平台面上俟其凝固，翻转平板，在36℃半开皿倒置约1h，以烘干培养基表面水分，并使琼脂具有显著的吸水性。
            　　6.2.2　试验菌液的准备
            　　从选择性鉴别平板上挑取菌落，一般应多挑几个菌落，以防遗漏。检验沙门氏菌时，不但应挑取乳糖阴性产H2S和不产H2S的菌落，还应挑取乳糖阳性产H2S的菌落。检验大肠埃希氏菌时应挑取乳糖阳性或阴性的菌落3～5个。检验志贺氏菌时应挑取可疑菌落接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体管，于36℃培养过夜，次日选取三糖铁底层产酸、斜面产碱，不产H2S，不产气无动力的培养物。
            　　下述两种方法可供选用。
            　　6.2.2.1　一法：将待试菌落接种于营养肉汤管内，于36℃培养过夜。挑取此肉汤培养物一满环，稀释于一管盛有1～2mL的蛋白胨水试管内，使成为1∶200～1∶400稀释菌液，含菌量约为1×106/mL。
            　　6.2.2.2　二法：用接种针在鉴别平板上轻轻蘸取可疑菌落，挑取菌量不宜过多，稀释于一管盛有1～2mL蛋白胨水试管内，使其含菌量约与一法相似。
            　　6.2.3　涂抹试验菌液
            　　6.2.3.1　斑点涂抹法：将营养琼脂平板表面自圆心起分为三等份，每等份可供涂抹一株细菌培养物。每挑取试验菌液一满环，涂抹直径约1cm的菌斑一个。每株培养物涂抹7个菌斑，外圈4个，内圈3个。
            　　6.2.3.2　棉签涂抹法：用无菌棉签蘸取试验菌液并略挤去过多液体，在如上琼脂平板表面三分之一的区域内涂抹。三个涂抹区之间保持适当距离。
            　　略等数分钟，俟菌液干燥。
            　　6.2.4　滴加噬菌体
            　　用定量乳头滴管在一个菌斑上滴加噬菌体一滴，依次为O-I、C、Sh、E、CE、E－4和Ent。滴管上安装4号针头，每毫升约为100滴。每支滴管只滴加一种噬菌体，针尖绝对不能接触平板表面，严格防止交叉污染。每用一支滴管，可把全部待试菌应滴加噬菌体的菌斑部位全部滴加完毕。滴加噬菌体时必须将琼脂平板放在水平台面上。待7种噬菌体均滴加完毕后，略等数分钟，待噬菌体液干燥。翻转平板，放36℃培养5～6h，并过夜各观察一次结果。
            　　如果仅有一两株培养物作噬菌体试验，则可用直径为3mm的接种环挑取噬菌体，依次滴加在菌斑上。灼热的接种环必须完全冷却以后方可挑取噬菌体。
            　　6.2.5　试验结果的判定
            　　按表1判定噬菌体试验的结果。必要时吸取少许剩余的蛋白胨水培养物作靛基质试验，大肠埃希氏菌培养物一般为靛基质阳性。
            　　表1　肠杆菌科噬菌体诊断表
            　　（表略）
            　　6.2.6　供快速检验沙门氏菌的噬菌体简化诊断法
            　　采用如下3种噬菌体：
            　　a.沙门氏菌C－I噬菌体；
            　　b.E多价噬菌体，包括E和Sh；
            　　c.C多价噬菌体，包括C、CE和Ent。
            　　培养基和试验菌液的准备均同前法。
            　　涂抹试验菌液：斑点涂抹法将琼脂平板表面分为四等份，每等份可供涂抹一株细菌培养物。每株培养物涂抹3个菌斑，外圈2个，内圈1个。棉签涂抹法可将试验菌液在琼脂平板上涂抹成带状，每个平板约可涂抹5条菌带。略等数分钟，俟菌斑干燥。
            　　依次滴加上述3种噬菌体，在36℃培养5～6h，并过夜各观察一次结果。按表2判定简化诊断法的结果。
            　　表2　三滴法噬菌体试验简化诊断表
            　　（表略）
            　　6.3　噬菌体不裂解培养物的补充生化试验
            　　有少数的沙门氏菌培养物不被O－I噬菌体裂解，并有少数的大肠埃希氏菌培养物不被相应噬菌体裂解。故应将不被各种噬菌体裂解的培养物接种三糖铁琼脂。以下分别按GB
            4789.4和GB 4789.6进行。

6.4　血清学分型鉴定
            　　6.4.1　沙门氏菌，按GB 4789.4进行。
            　　6.4.2　致泻大肠埃希氏菌，按GB 4789.6进行。
            　　6.4.3　志贺氏菌
            　　6.4.3.1　记录噬菌体试验的结果，并按表3判定血清学分型鉴定的方向。Sh噬菌体不裂解的培养物不属于志贺氏菌。已知全部志贺氏菌培养物均能被Sh噬菌体裂解，且将其稀释至1RTD时，有99%的志贺氏菌培养物仍应被裂解。
            　　表3　噬菌体试验的结果和志贺氏菌血清学分型鉴定的方向
            　　（表略）
            　　挑取三糖铁琼脂上的培养物，按噬菌体裂解模式，选用相应的志贺氏菌分型因子血清，做玻片凝集试验。如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查。
            　　6.4.3.2　如按噬菌体裂解模式提示为福氏志贺氏菌1～5型，可先用福氏多价血清做凝集试验。如果呈现凝集，再分别用各型和群因子血清检查，以确定所属血清型和亚型(见GB
            4789.5表2)。
            　　6.4.3.3　如按噬菌体裂解模式提示为福氏6型，鲍氏各型或痢疾3～12型，可先用福氏6型血清做凝集试验。福氏6型血清不凝集者，可用鲍氏多价血清或痢疾3～12多价血清做凝集试验。如果吴现凝集，再分别用各型因子血清检查。
            　　6.4.3.4　如按噬菌体裂解模式提示为宋内氏Ⅱ相菌而不被宋内氏血清凝集时，可直接按噬菌体裂解模式和粗糙形菌落特征判定之。
            　　6.4.3.5　按噬菌体裂解模式所提示的方向做血清学试验不凝集者，或虽发现其被某一个分型因子血清凝集而与噬菌体裂解模式不相符者，或虽与噬菌体裂解模式相符但不被1RTD的Sh噬菌体裂解者，均应做葡萄糖铵试验以与大肠埃希氏菌相鉴别。葡萄糖铵试验阳性者为大肠埃希氏菌。必要时还可以做如下的生化试验，即：乙酸钠、克氏柠檬酸盐和粘液酸的利用试验，赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶、七叶苷的分解试验。除宋内氏菌和鲍氏13型为鸟氨酸阳性、宋内氏菌的少数菌株可利用粘液酸，福氏4a型的少数菌株可利用乙酸钠外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。这些试验中任何阳性结果均提示为大肠埃希氏菌。
            　　6.4.3.6　检出的志贺氏菌培养物应符合该群的生化特性(见GB
            4789.5表3)，但福氏6型与A群或C群相似。靛基质阳性的志贺氏菌血清型为痢疾2型、7型和8型，鲍氏5、7、9、11、13、15、16和17型，但福氏1～5型的靛基质反应较弱；靛基质阴性的志贺氏菌血清型为痢疾1型、3～6型、9～12型、福氏6型、鲍氏1～4，6，8，10，12，14和18型，和宋内氏菌。
            　　6.5　大肠埃希氏菌肠毒素试验
            　　按GB 4789.6进行。
            　　6.6　结果报告
            　　6.6.1　沙门氏菌检验的结果报告
            　　6.6.1.1　O－I噬菌体裂解，其他均不裂解者，经沙门氏菌血清分型后报告；或符合上述裂解结果，但尚未做血清分型试验者，可报告为沙门氏菌未分型。
            　　6.6.1.2　各种噬菌体均不裂解，但生化试验确定为沙门氏菌，经沙门氏菌血清分型后报告；或符合上述生化试验结果，但尚未做血清分型试验者，可报告为沙门氏菌未分型。
            　　6.6.1.3　非如上述的裂解结果，或生化试验否定为沙门氏菌者，可报告为非沙门氏菌。
            　　6.6.2　志贺氏菌检验的结果报告
            　　6.6.2.1　Sh噬菌体裂解，呈现各种裂解模式，血清学试验与裂解模式相符者，可报告志贺氏菌分型结果。罕见血清型要求被1 RTD
            Sh噬菌体裂解，并符合志贺氏菌生化分群结果。
            　　6.6.2.2　　非如上述的试验结果均报告为非志贺氏菌。
            　　6.6.3　致泻大肠埃希氏菌检验的结果报告
            　　6.6.3.1　E和或Sh、E－4噬菌体裂解，不同来源菌株的裂解模式具有同一性，经血清学分型确定者可分别报告为产肠毒素大肠埃希氏菌(要求有肠毒素试验结果)，侵袭性大肠埃希氏菌(要求赖氨酸阴性、动力阴性，但O124亦可为动力阳性)，肠道出血性大肠埃希氏菌(限于O157)或肠道致病性大肠埃希氏菌。
            　　6.6.3.2　各种噬菌体均不裂解，经生化试验符合大肠埃希氏菌，并经血清学分型确定者，亦可分别报告各类致泻大肠埃希氏菌，其要求与6.6.3.1相同。
            　　6.6.3.3　非如6.6.3.1和6.6.3.2结果均报告为非大肠埃希氏菌或非致泻大肠埃希氏菌。
            　　附加说明：
            　　本标准由卫生部卫生监督司提出。
            　　本标准由江西省卫生防疫站负责起草。
            　　本标准主要起草人何晓青。
            　　本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。

深圳水质检测中心就是用酶底物发做的.这个方法简单,操作方便,速度也比较快,但是成本太高.

原文由 linkjoe 发表:
酶底物法（国标）已发布，我这里有资料。

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