主题：【原创】融合蛋白纯化小攻略-融合蛋白常见问题解析

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月旭

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发表于：2019/09/29 16:33:50 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

月旭科技秉持分享传承生物制药相关技术，汇集生物制药相关细分技术，以生物技术分享传承和助力发展为初衷，月旭材料是集生物分离纯化介质研发、生产、销售于一体的高新技术企业。
公司专注生物分离填料的研制和生物工艺下游技术工艺开发。有琼脂糖微球填料，葡聚糖微球填料，琼脂糖交联葡聚糖微球填料，琼脂糖交联纤维素微球填料，琼脂糖交联纤维素交联葡聚糖微球填料，涵盖离子交换，亲和，排阻和疏水等多款高品质填料。
融合蛋白不挂金属螯合亲和层析柱
01 可能原因：超声的功率不对( 太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放)
解决方法：改变超声功率或超声前尝试添加溶菌酶增加细胞破碎率。
02 可能原因：组氨酸标签暴露不完全
解决方法：在变性条件下( 用4-8 M 脲，或4-6 M 盐酸胍) 进行纯化，常规Ni-6FF(IDA) ,在变性条件下镍离子容易脱落，此时可选择耐受变性剂的螯合填料（推荐月旭材料的亲和填料Ni Tanrose FF(NTA)。
03 可能原因：His标签丢失
解决方法1：WB 检查His 是否表达，上游构建，改变His-tag 的位置(C- 端或N- 端)，必要时增加His 个数。
解决方法2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间。
解决方法3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。
解决方法4：选择高载量高特异性的螯合填料（月旭材料的亲和填料 Ni Tanrose FF（IDA) )。
融合蛋白结合在螯合填料上洗脱不下来
01 可能原因：洗脱条件太温和(融合蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强)
解决方法：增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。
02 可能原因：降低pH 的方法洗脱，若pH 低于3.5，会导致镍离子脱落
解决方法：改变洗脱办法，咪唑竞争性洗脱。
03 可能原因：蛋白已沉淀在柱上
解决方法1：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度，或在变性条件( 去折叠) 下洗脱( 用4-8 M 脲，或4-6 M 盐酸胍)。
解决方法2：蛋白在柱上变性固化，用0.5M氢氧化钠洗柱。
04 可能原因：非特异性疏水或其他相互作用

解决方法：加非离子去污剂到洗脱缓冲液(如：2% Triton X-100)或增加NaCl 的浓度。

05 可能原因：在填料表面形成高密度融合蛋白的聚集
解决方法：选择合适载量的填料，切勿一味追求高载量。
镍柱使用中出现棕色是怎么回事
01 可能原因：缓冲液中DTT的影响， DTT会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响,在碱性的缓冲液条件下，镍离子会被DTT还原生成棕色的沉淀，所以要尽量避免DTT的参与。
解决方法：若样品中含有DTT，在上样之前, 我们推荐采用不含还原性试剂的空白运行来除去任何较弱结合的镍离子；空白运行方法（使用不含还原剂的平衡液和洗脱液）
1）5倍柱体积的双蒸水洗柱；
2）5倍柱体积的平衡液洗柱；
3）5倍柱体积的洗脱液洗柱；
4）10倍柱体积的平衡液平衡。当不使用时，勿将Ni Tanrose 6FF（IDA）保存于含还原性试剂的缓冲液中。

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