2,3-二氨基萘可见分光光度法测定预混合饲料中硒含量

摘要

硒是动物体必需的微量元素，硒摄入量过多和过少都会造成机体的异常，对动物微量元素预混合饲料中的硒进行定量测定以确保合理的硒添加量尤其重要。本文通过实验摸索最佳的衍生条件和方法学验证，建立2,3-二氨基萘可见分光光度法测预混合饲料中硒的含量，结果最佳的测定波长为378 nm，硒含量在0～20 μg范围内符合朗伯比尔定律，线性回归方程为A=0.0607Cx+0.0109，相关系数R²=0.9997，方法的稳定性良好，检测限为0.0106 mg/g，加标回收率在94%～106%之间，平行测定的RSD均小于2%，与国标法比较的相对误差为。结果表明建立的方法精密度、准确性及稳定性良好，为微量元素预混合饲料硒的测定提供一种更简便低廉的方法。

关键词：二氨基萘；分光光度法；硒；预混合饲料

1 引言

硒是动物体必不可少的一种微量元素，在动物体正常生理功能中发挥重要的作用。硒能提高动物体抗氧化能力、免疫力、抗炎功能等，对畜禽的生长发育、繁殖功能和生长性能有重要影响^[1]。有研究发现我国基础饲粮原料中的硒含量仅能提供猪和鸡硒营养需要的约1/4^[2]，而动物体硒的缺乏会导致多种疾病的产生，通过在动物饲料中添加矿物质微量元素硒以保证畜禽的硒营养需要是目前养殖业的重要途径^[3,4]。但是硒作为动物体的一种微量元素，饲料中硒添加过量会造成动物的中毒^[5,6]，配合饲料添加硒来源主要为微量元素预混合饲料和复合预混合饲料，因此对预混合饲料产品中的硒含量进行测定，能有效控制配合饲料中的硒含量。

目前对饲料中硒的测定方法主要有氢化物原子荧光光谱法和2,3-二氨基萘荧光法^[7]，这些方法需要原子荧光光度计和荧光光度计，该仪器价格昂贵，用途单一，在饲料生产企业中普及率较低，因此开发一种对仪器要求低，实验中使用的试剂毒性小，适合普通饲料企业对预混合饲料中硒的测定方法有较大的实用意义。可见分光光度计仪器设备简单、价格低廉，饲料企业配置率高，易于推广。用分光光度法测硒是一种常用的方法^[8]，如3,3’-二氨基联苯胺分光光度法测定水质总硒^[9]、紫外分光光度法测定大米中微量元素硒的含量^[10]、分光光度法测定富硒蛋粉中的硒含量^[11]等，经验证用3,3’-二氨基联苯胺分光光度法测定预混合饲料中硒稳定性差、干扰严重。经检索，当前2,3-二氨基萘分光光度法^[^12～14^]测定预混合饲料中硒含量的研究报道很少。本法在酸性条件下，四价硒与2,3-二氨基萘反应生成4，5-苯基苯并硒二唑（成4,5-苯并苤硒脑）能被分光光度计检测并符合朗伯比尔定律^[1⁵^]，本文通过优化方法条件，为预混合饲料中硒含量的测定提供了一种操作简便、成本低廉、安全环保的方法。

2 材料与方法

2.1 材料

实验样品为市售微量元素预混合饲料。

2.2 主要仪器与试剂

TU-1901双光束紫外可见分光光度计（配1 cm石英比色皿），北京普析通用仪器有限责任公司；BSA224S分析天平，德国Sartorius公司；PHSJ-3F实验室pH计，上海雷磁公司。

硒标准贮备液：准确称取100 mg硒粉于100 mL烧瓶中，加入5 mL水和2 mL硝酸溶解，加2 mL高氯酸，置沸水浴中加热回流3 h，冷却后加入8.4 mL盐酸，置沸水中水浴2 min，用水移入1000 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，4 ℃保存，此溶液含硒100 μg/mL；硒标准中间液：精密量取2.00 mL硒标准贮备液至200 mL容量瓶中，用水稀释定容至标线，摇匀，此溶液含硒1 μg/mL，邻用新制；2,3-二氨基萘（DAN）溶液：称取0.1 g 2,3-二氨基萘于100 mL容量瓶中，加入50 mL 0.1 mol/L盐酸溶液，超声10 min至完全溶解，定容至刻度，摇匀，过滤，滤液移入分液漏斗，加入20 mL环己烷振荡2 min，待分层后弃去环己烷，水相重复用环己烷处理3次，水相放入棕色瓶中上面加盖1cm厚环己烷，在暗处4℃保存，此溶液有效期一周，且取用次数最多3次；盐酸溶液：3 mol/L；盐酸溶液：0.1 mol/L；氨水溶液：1+1；甲酚红指示剂：0.4 g/L；盐酸羟胺溶液：25 g/L，邻用新制；5% EDTA-2Na溶液。以上试剂盐酸和硝酸为优级纯，2,3-二氨基萘为荧光级(HPLC，>97%)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2.3 方法
2.3.1 样品处理
取待测微量元素预混合饲料样品混匀，精密称取1.0 g（根据样品硒含量称取适宜的量）于100 mL烧杯中，加入10 mL水和15 mL硝酸，盖上表面皿，置电炉上加热并保持微沸30 min，取下用水移入200 mL容量瓶中，超声溶解5 min，用水稀释至刻度，摇匀，即为试样溶液。过滤，精密量取续滤液2.00 mL（以含硒量2～10ug为佳）于50 mL烧杯中，加入3 mL水、2 mL高氯酸，混匀，置电炉上加热由低温升温至高氯酸冒浓白烟并保持冒烟5～10min（约剩余1～2 mL液体），取下冷却，加入1 mL水和1 mL 3 moL/L盐酸溶液混匀，置电炉上加热煮沸，取下摇匀，放冷10 min以上，即为消化液。

将消化液用水完全转移至50 mL具塞比色管中，加水稀释至25 mL，加入3 mL盐酸羟胺溶液和1.5 mL EDTA溶液，摇匀，加入2滴甲酚红指示剂，摇匀，用氨水溶液中和至恰好变黄色，滴加3 moL/L盐酸溶液至恰变浅橙色后再过量2滴至橙色（pH≈1.5～2，必要时可用精密pH试纸测定），加入2.5 mL 2,3-二氨基萘（DAN）溶液，塞紧塞子，摇匀，打开塞子，置于100 ℃沸水中水浴5 min，取出用冷水冷却至室温，用0.1 mol/L盐酸溶液稀释至50 mL，加入5.0 mL环己烷，塞紧塞子，充分振摇萃取2 min，静置分层。吸取上层的环己烷溶液即为待测样品溶液。同时同样制备试样空白溶液。

2.3.2 标准工作曲线的制备
分别量取0.00，1.00，2.00，3.00，5.00，10.00，20.00mL硒标准中间液于50 mL具塞比色管中，以下按“2.3.1 加水稀释至25 mL，加入3 mL盐酸羟胺溶液和1.5 mL EDTA溶液”后的步骤操作。吸取上层的环己烷溶液即为硒标准工作溶液，此硒标准系列溶液的硒含量分别为0μg、1.0μg、2.0μg、3.0μg、5.0μg、10.0μg和20.0μg。同时同样制备标准空白溶液。

2.3.3 样品测定
以环己烷校零，在378 nm波长处用紫外可见分光光度计，分别测定空白溶液、硒标准工作溶液、待测样品溶液的吸光度值。以标准工作溶液的硒含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准工作曲线，从标准工作曲线中查得样品溶液的硒含量（C_X），根据下列公式计算样品的硒含量（X）。

X（mg/g）=C_X×200/（1000×m×V）

式中：C_X为标准工作曲线中查得的样品溶液硒含量（μg）；m为称取的样品质量（g）；V为吸取的试样溶液的续滤液体积的数值。

3 结果

3.1 标准工作曲线的绘制

分别量取0.00，1.00，2.00，3.00，5.00，10.00，20.00mL硒标准中间液于50 mL具塞比色管中，以下按“2.3.1 加水稀释至25 mL，加入3 mL盐酸羟胺溶液和1.5 mL EDTA溶液”后的步骤操作。吸取上层的环己烷溶液即为硒标准工作溶液，此硒标准工作溶液的硒含量分别为0μg、1.0μg、2.0μg、3.0μg、5.0μg、10.0μg和20.0μg。同时同样制备标准空白溶液。分别测定标准空白溶液、硒标准工作溶液的吸光度值，以硒标准工作溶液的硒含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制硒标准工作曲线。结果如图1所示，硒含量在0～20 μg时与吸光度值呈良好的线性关系，回归方程为A=0.0607Cx+0.0109，相关系数R²=0.9997。