主题：【第十五届原创】HPLC溶剂效应Case-study

背景

在检测某化合物纯度时，样品纯度较低（仅80%），RT=2.6min杂质过大（16.203%），峰形也明显不正常，为肩峰。



分析方法



异常调查

该样品配样方式：0.5mg/mL，50%ACN稀释，进5ul。对比技术包，发现稀释剂应该用ACN。将样品严格按照技术包（ 0.5mg/mL，ACN稀释，进5uL）配制进样，结果发现峰高过载（杂质检测结果失真）。调整进样量为2uL ，重新进样发现RT=2.6min杂质变大，由0.609%→1.947%。



一开始怀疑是由于样品不稳定造成的，后将样品先配现进（ 0.5mg/mL，ACN稀释，进2uL ），并且连续进样，发现样品在ACN中稳定。结果如图：



杂质裂分成两个明显的峰，且RT=2.4min+RT=2.6min杂质大小保持不变，调取紫外吸收波长显示两者的紫外吸收基本一致。

排除样品不稳定因素，初判断为溶剂效应。

异常解决

1. 降低进样量

      调整进样量（0.5uL 或1uL ），溶剂效应消失。故重新配样（ 1.0mg/mL，ACN稀释，进1uL ）检测异常样品，RT=2.6min杂质为7.581%。但样品ACN稀释溶解度不好，需超声较长时间。



2. 更换稀释剂

50ACN%稀释进样（ 0.5mg/mL，进5uL ）溶剂效应存在，进样量为2uL时，溶剂效应消失，但在50%ACN中样品发生水解，RT=2.6min杂质变大（16.037%），用MeOH做稀释剂亦是如此。



3. 更换与流动相初始比例相近的稀释剂

用0.1%TFA:ACN=60:40稀释，进样量5uL，未出现溶剂效应，RT=2.6min杂质为8.189%，样品在该溶剂中稳定存在。



方案3改成余流动相相近的稀释剂适用于该方法的分析

总结

溶剂效应：液相反应中，溶剂的物理和化学性质影响反应平衡和反应速度的效应。可能造成色谱峰展宽、分叉、保留时间漂移、峰面积变化，双峰等现象。与此同时，较早洗脱的峰出现前沿或分叉，较晚洗脱的峰峰形正常。

产生原因：样品进入高效液相色谱中，当溶剂与流动相存在差异时，一部分样品溶解进入了流动相，一部分还留在溶剂里造成色谱保留的差异。造成这种差异的原因主要有溶剂强度、进样体积、流动相与溶剂的兼容性、溶剂pH等。

进样体积导致的溶剂效应：使用强度大于该样品出峰时流动相强度的溶剂，增加进样体积后，目标分析物色谱峰会向前迁移，直至裂分，并且峰高变小峰宽变大。这是因为进样体积较小时，扩散至流动相的目标分析物占绝大多数，除了保留时间略微提前，峰形以及峰宽与流动相溶解时基本一致。体积增大到一定程度，扩散至流动相氛围的目标物与留在溶剂氛围的目标物在数量上相当时，色谱峰分叉明显。当样品体积进一步增大，绝大多数目标物进入色谱柱时是溶解在溶剂中的，目标分析物的色谱峰已经明显向前迁移了。



PS：当出现样品与空白峰叠不上的情况，可以多注意一下，及时发现异常情况。



知识拓展

溶剂效应产生过程解析：

第一阶段：样品刚被注入系统，进入色谱柱后，流动相氛围中的目标物以正常速度被洗脱。因强溶剂洗脱，移动速度快。样品在空间上开始慢慢分裂



第二阶段：在一定时间内，溶剂氛围中的目标物移动始终快一些，前后两部分距离扩大。但移动快的目标物所处氛围逐渐被流动相稀释(注：因为溶剂和流动相均不保留)，其移动速度会逐渐降至正常流速。直到前面目标物的氛围完全被流动相替代，前后两部分的距离稳定下来。因而，样品溶剂与流动相洗脱强度差距越大，两部分目标物最终的距离拉的越大。



第三阶段：所有目标物在色谱柱中正常移动，但分裂已不可逆转



经过检测器，同一目标物给出了两个色谱峰。其中进柱前即扩散进入流动相的那部分目标物组成了后面的色谱峰，它的保留时间与目标物的真实保留时间基本吻合。            更多精彩内容可关注“研发分析之路”，留言小编交流