主题：【第十五届原创】液质联用仪的农药直线做不直？秘诀教给你！

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zyl3367898

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农检联合队发表于：2022/10/08 23:11:07 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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液质联用仪的农药直线做不直？秘诀教给你！

GB 23200.121《食品安全国家标准植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定液相色谱-质谱联用法》中，要绘制农药的标准曲线，在实际工作中发现标准曲线的R值很难达到0.995，花费时间去研究了一些农药的标准曲线，找到了解决办法，现在分享给大家。
一、问题描述
按照国标23200.121方法，标准曲线的浓度点是8个浓度点，按照这8个浓度点来配制，有些农药标准曲线R值很难达到0.995以上，选择其中5个浓度点来做，还是有一部分农药的标准曲线做不成，那么如何选择浓度点呢？如何把标准曲线做好呢？

图1：GB 23200.121-2021标准上的标准曲线浓度点

图2：部分农药标准曲线图

二、解决办法
（一）获取正确的离子对和电压值
比如阿维菌素，照抄国标方法，做出来的农残标准曲线相关系数很差。选择加铵峰还是加钠峰的离子对，与农药本身性质有关，与流动相也有关系，要经过多次实验才行。选择正离子模式还是负离子模式，要在仪器上测试离子丰度，选择丰度最强、受干扰小的定性离子与定量离子。
1.阿维菌素出加铵峰还是加钠峰
（1）色谱条件
色谱柱：Altantis T3柱（150mm×2.1mm，3.0μm）；柱温：40℃；流动相：A相为水（含0.01%甲酸（v/v)和1mM/L甲酸铵），B相为甲醇（含0.01%甲酸（v/v)和1mM/L甲酸铵）。柱流速为0.40mL/min。梯度洗脱程序：0～2.0min，90%A；5.0～12min，5%A；12.1～13min，90%A；流速：0.4mL/min；进样量：1μL。
（2）质谱条件
离子源：ESI；扫描方式：正离子扫描；扫描方式：多反应监测（MRM）模式；电喷雾电压：4500V；雾化气压力：50psi；气帘气压力：30psi；辅助加热气：60psi；离子源温度：300℃；碰撞气压力：9psi。
（3）检测离子的选择
阿维菌素的分子式是C₄₈H₇₂O₁₄,理论分子量为872.4921。采用母离子扫描(MS Scan),获得一级质谱图，通过分子质量确定阿维菌素多以加合离子[M+NH₄]⁺、[M+Na]⁺、[M+H]⁺形式存在，本实验选择离子丰度极强的[M+NH₄]⁺(m/z890.5)作为母离子。然后，优化毛细管电压等参数，使母离子强度达到最高。
选择母离子后，进行子离子扫描(Daughter Scan),获得二级质谱图，得到305.2、567和145.1。进行MRM多反应监测扫描，再次优化离子源温度、脱溶剂气温度等参数，使其离子化效率达到最佳。最终，本实验选择丰度最强、受干扰小的890.5/567作为定性离子对，而890.5/305.2作为定量离子对。阿维菌素检测的质谱参数见表1。

图3：阿维菌素标液的MRM总离子及选择离子的离子流色谱图（10μg/L)
Fig.1 MRM chromatograms of abamectin(10μg/L)A. 总离子图谱（Chromatogram of total ion)B.定量离子图谱（Chromatogram of quantitative ion);C.定性离子图谱（Chrom
atogram of qualitative ion)

图4：阿维菌素不同离子对的直线对照图
1.2辛硫磷
GB23200.121标准上辛硫磷的离子对是299.1/129.0与299.1/153.0，DP电压值是55V，CE电压值分别是18V/10V，用这个条件来做，标准曲线的相关系数只有0.94775。
配制辛硫磷1.0ug/mL，选择针泵进样，选择SCAN模式，选择母离子扫描与子离子扫描，选择丰度最强、受干扰小的299.1/77.0作为定性离子对299.1/129.0作为定量离子对。优化CE与DP值，DP值为61V，CE值为42V/18V。

图5：辛硫磷的SCAN模式扫描

图6：辛硫磷农药的直线对比

（二）配直线，看响应值。
农药配制成2.0ug/mL的混标，然后按0.005ug/mL，0.01ug/mL，0.05ug/mL，0.10ug/mL，0.20ug/mL，查看农药的峰面积达到7位数时的浓度，做详细记录。因为当峰面积达到7位数的时候，仪器就处于饱和状态，再往上面的浓度点不会成比例增加，这也造成了这条直线做不直。
1. 选择合适的浓度点配制标曲。
根据农药浓度的响应值分组配置标准曲线，仪器的响应度达到7位数后，已经饱合，再配更大的浓度，响应度不会成比例增加，这样就造成了标准曲线斜率不好。比如说0.2ug/mL的达到了七位数，那么这条直线就只能做到0.2ug/mL，如果有的农药在0.01 ug/mL或者0.05 ug/mL的时候已经达到了七位数，那么它的最高浓度点只能做到0.01 ug/mL或0.05 ug/mL，整个直线可以选择更低的浓度来绘制。具体的浓度点与标准曲线见表2-表5。

图7：高浓度点农药标准曲线

图8：低浓度点农药标准曲线

2. 基质配标曲
基质效应在农残中一直存在，在液质联用仪上表现的是基质抑制效应，各农药的基质效应也不相同。比如甲拌磷0.05ug/mL用甲醇配制和用1：1甲醇水配制，用笋瓜基质来配制，响应值比例大概为1:0.79:0.75。而嘧霉胺这三者的比例为1:0.78:0.66.

图9：不同溶剂配制的峰面积

为了数据准确可以用基质配标准曲线，每种蔬菜的干净基质都要收集，工作量很大。如果要做200个样品，各种蔬菜水果食用菌的品种比较多，那么用哪一种基质来配制标线呢？这都是一个很难的问题，在做大批量检测的时候，还是建议用甲醇配制标准曲线，如果有检出数据，再使用同品种的干净基质配标准曲线得出准确的数据。
3. 样品检测
当做大批量样品的时候，可以分别用上面两组直线去计算样品含量，如果用高浓度的那条直线，可能样品的含量不会超过直线的浓度点，但是如果用低浓度的那条直线来计算样品的含量，大多数都会超过最高的浓度点0.05ug/mL，如何解决这个问题呢？
先将所有的样品用两条直线计算出来含量，如果发现样品含量已经超过最高的浓度点，可以采取两个办法，一是对样品进行稀释，不能超过直线的最高点；二是根据样品的含量，用相同的样品基质配相近的浓度点进行单点校正，得出准确的数据。

图10：样品的色谱图

三、结论
按照标准方法来配制标准曲线的时候，如果发现直线的相关系数R做不到0.99以上，要找到相应的解决办法。
1. 不同厂家的液质联用仪在农药的响应值上略有差异，要在使用的仪器上找到响应值最高的离子对和合适的碰撞电压和去簇电压值。
2. 当仪器的响应值饱和以后，会导致直线做不直，这时候要根据仪器响应值选择相应的浓度点配制，标曲的最高点不得超过仪器的响应值。
3. 样品检测的时候也要对样品进行稀释，使样品含量落在标准曲线的范围之内。
4. 样品在液质联用仪上呈现的是基质抑制效应，如果用基质配标准曲线，要根据响应值来确定浓度点是高浓度，还是低浓度，可能会与用溶剂标的浓度点不相同。
5. 在应对标准曲线的相关系数达不到要求的时候，一定要灵活掌握，找到合适的办法，做出准确的数据。