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主题：【第十五届原创】探究水性乳液中杀菌剂残留量与细菌含量的关系

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万华宁波技师工作室发表于：2022/11/08 15:31:19 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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年度二等奖

探究水性乳液中杀菌剂残留量与细菌含量的关系

吕炎张艳艳刘翔唐世旭王柳

万华化学(宁波)有限公司

摘要：本文通过实验探究水性乳液中杀菌剂残留量与细菌含量的关系。通过对乳液储存温度、乳液黏度、细菌种类及菌种接种量等影响因素的进行研究，发现水性乳液受到细菌污染后，在异噻唑啉酮类杀菌剂体系中，细菌含量随着时间的变化降至零，但乳液体系中的杀菌剂残留量基本不会发生损耗。

关键词：水性乳液异噻唑啉酮类杀菌剂残留细菌含量影响因素

1、背景

水性乳液作为工业涂料的重要生产材料，对于乳液中的微生物含量(细菌、酵母菌和霉菌等)要求极高，但细菌在生活中无处不在，且适应性极强，水性乳液中含有大量的水和营养物质，当温度合适时适合微生物的大量繁殖。当水性涂料中微生物的数量达到一定数量，就会出现降粘、变色、异味等问题，这样会大大降低产品的性能及质量，导致客户对于产品的使用满意度下降。

为了控制水性乳液中微生物的生长，通常情况下，为了避免产品变质，生产中常选择在水性乳液中添加杀菌剂，实现对微生物的抑制作用。目前生产中常用异噻唑啉酮类杀菌剂实现微生物地抑制，但微生物会随着环境的变化而不断地进化变化。而目前的杀菌剂还不足以完全杀灭或抑制微生物的生长，因此导致了微生物抗性的提高，进而使产品的防霉防腐效果下降。因此本文通过实验研究水性乳液中添加地杀菌剂含量于可能存在地细菌含量地关系。

2、微生物生长与培养简介

2.1 细菌生长曲线

细菌生长主要包括四个阶段——迟缓期、对数期、稳定期和死亡期，见图1。

迟缓期主要为为细菌进入新环境的适应阶段，此阶段细菌体积增大，代谢活跃，但不分裂，主要是合成各种酶、辅酶和代谢产物，为今后的增殖准备必要的条件。

对数期细菌则以几何级数恒定快速增殖，在曲线图上，活菌数的对数直线上升至顶峰。此阶段细菌的大小、形态、染色性、生理活性等都较典型，对抗生素等外界环境的作用也较为敏感，细菌的鉴定等选用此期为佳。

稳定期时细菌消耗培养基中营养物质，毒性代谢产物积聚，pH下降，使细菌的繁殖速度渐趋减慢，死亡数逐步上升，此阶段细菌繁殖数与死亡数趋于平衡。细菌形态和生理特性发生变异，如革兰阳性菌可能被染成阴性菌；同时细菌产生和积累代谢产物，如外毒素、抗生素等；芽胞也多在此期形成。

衰亡期时细菌繁殖速度减慢或停止，死菌数迅速超过活菌数。此阶段细菌形态显著改变，菌体变长、肿胀或扭曲，出现畸形或衰退型等多形态，有的菌体自溶，难以辩认，代谢活动停滞。

图1：细菌生长曲线

2.2 细菌的培养

2.2.1培养基的组成

培养基主要为微生物生长提供营养物质，主要包括5大类：碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。碳源主要有无机碳源和有机碳源两种，常用的碳源有糖类、油脂、有机酸和低碳醇等，主要在微生物生长过程中提供能量，同时也是构成细胞的重要物质；氮源主要也是无机氮源和有机氮源两种，常用的氮源有尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等，主要用于合成蛋白质、核酸及含N的代谢产物；生长因子则为微生物生长不可缺少的微量有机物，常见的生长因子：维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等，主要是酶和核酸的组成成分；无机盐是细胞维持生命活动所不可缺少的营养成分，主要有Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、PO₄^3-、SO₄^2-、HCO₃^-等，主要作用为维持细胞培养液渗透压平衡，参与细胞的代谢活动。此外，通过提供钠，K⁺和Ca²⁺，帮助细胞调节细胞膜功能。

2.2.2培养基的类型及用途

培养基一般按照它的化学分类、物理分类及用途进行分类，详见表1中内容。

表1：培养基的类型及用途介绍

划分标准	培养基种类	特点	用途
物理性质	液体培养基	不加凝固剂	工业生产
	半固体培养基	加凝固剂，如琼脂	观察微生物的运动、分类鉴定
	固体培养基	加凝固剂，如琼脂	微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
化学性质	天然培养基	含化学成分不明确的天然物质	工业生产
化学性质	合成培养基	培养基成分明确	分类、鉴定
用途	选择培养基	在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长	培养、分离出特定微生物
用途	鉴别培养基	在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物	鉴别不同种类微生物

目前在工业生产中常选用琼脂平板培养细菌，采用孟加拉红平板培养真菌等。孟加拉红平板中主要添加了一定量的氯霉素用于抑制细菌的生长，同时添加的孟加拉红试剂作为选择性抑菌剂可以抑制细菌的生长，并可缓解某些霉菌因生长过快而导致菌落蔓延生长等。

3、异噻唑啉酮类杀菌剂介绍

3.1 异噻唑啉酮类杀菌剂介绍

异噻唑啉酮类杀菌剂是一种杂环结构，其杀菌原理主要依靠杂环上的活性部分破坏细菌细胞内的DNA分子，使细菌失去活性。异噻唑啉酮类杀菌剂因为其高效、广谱、低毒的优点被认为是在水处理应用中最好的杀菌剂，同时在钢铁冶炼、油田注水、炼油厂、火力发电厂、大型化肥厂、造纸厂、轻纺、水性涂料、工业清洗等领域也广泛应用。

常见的异噻唑啉酮类杀菌剂有：1,2-苯并异噻唑啉 -3-酮（BIT)、2-n-辛基-4-异噻唑啉-3-酮（OIT)、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MIT)、5-氯-2-甲基-4-异噻唑琳-3-酮（CMIT)。它们的共同特点是抗菌能力强、应用剂量小、相容性好、毒性低等优点，并且它对多种细菌、真菌都具有很强的抗菌作用。具有它们高效性、较好的配伍性、较宽的pH适用范围、能够自然生物降解。

3.2 异噻唑啉酮类杀菌剂生产工艺介绍

异噻唑啉酮类杀菌剂的主要有7种工艺，简单的工艺介绍如下：

1 由P-硫酮酰胺在惰性有机溶剂中齿化制备异噻唑啉酮，反应方程见下图：

图2：异噻唑啉酮类生产反应方程1

2 β-硫氰丙稀酷胺或硫代丙稀酷氨经酸处理（如硫酸）可制备异噻唑啉酮，反应方程见下图：

图3：异噻唑啉酮类生产反应方程2

3 将3-轻基异噻唑啉酮与南化剂反应得到异噻唑啉酮，反应方程见下图：

图4：异噻唑啉酮类生产反应方程3

4 在惰性溶剂中将二硫代二酰胺与卤化剂反应而制得异噻唑啉酮，反应方程见下图：

图5：异噻唑啉酮类生产反应方程4

5 以巯基酰胺为原料制备异噻唑啉酮，反应方程见下图：

图6：异噻唑啉酮类生产反应方程5

6 以二硫代二丙酰氯为原料进行闭环合成异噻唑啉酮类杀菌剂，反应方程见下图：

图7：异噻唑啉酮类生产反应方程6

7 以邻-N-取代苯丑胺为闭环原料合成异噻唑啉酮类化合物，反应方程见下图：

图8：异噻唑啉酮类生产反应方程7

4、探究水性乳液中杀菌含量与细菌含量关系

4.1 水性乳液中杀菌剂组成介绍

目前水性乳液中使用的杀菌剂为异噻唑啉酮类混合杀菌剂，主要以A、B和C这三种异噻唑啉酮类杀菌剂按照一定比例进行配比，启到快速高效地杀菌效果。三种杀菌剂以3：10：180（A：B：C）的理论比例进行混合杀菌。下图是选择多批次样品进行乳液中的杀菌剂残留测定后的统计图。

图9：水性乳液中杀菌剂A和B含量统计图

图10：水性乳液中杀菌剂C含量统计图

从上述2张图可知，部分样品中的A、B和C含量在生产过程种的添加值与理论值还是存在较大偏差，同时图10中有部分样品C含量损失严重，可能存在样品受到微生物的污染，因此我们需要通过实验进行探究现有的杀菌剂的添加量够杀灭微生物的数量。

4.2 实验探究方案介绍

结合现有资源，考虑乳液存放温度、细菌种类及细菌含量等影响因素，进行乳液中杀菌剂残留含量乳液中的细菌含量之间的关系，具体的实验方案见下表：

表2：乳液中杀菌剂残留与细菌含量关系的实验方案

4.3 菌种筛选

从乳液样品中进行菌种筛查，筛选出乳液中量种常见菌种——乳黄色菌种和乳白色菌种(目前实验室不具备从理化性质等方面进行细菌筛查，只能从细菌颜色进行单一筛选)，在进行细菌的培养传代过程中发现，乳黄色菌种生长快，乳白色菌种生长相对缓慢。

图11：菌种筛选传代例图

4.4 正交试验的设计

根据4.1中的实验方案，结合3种影响因素完成正交试验设计，共进行8组实验，具体方案见下表：

表3：正交试验设计方案

4.5 实验数据统计

根据上述制定的实验方案进行实验，并对实验数据进行统计汇总如下：

表4：实验数据统计表

选取第7组实验数据进行统计分析，分析图表如下：

图12：杀菌剂A含量与细菌含量的变化趋势图

图13：杀菌剂B含量与细菌含量的变化趋势图

图14：杀菌剂C含量与细菌含量的变化趋势图

图15：杀菌剂总量与细菌含量的变化趋势图

上述实验发现：在该杀菌剂环境下，乳白色菌种不易存活，含量1天内从10^5cfu/mL降为0，乳黄色菌种在该杀菌剂环境下，相对耐受，当细菌含量降至0时，且A、B和C含量均未发生显著变化。

4.6 实验分析讨论

4.6.1 菌种的影响

⑴乳白色菌种实验数据：

以下为乳白色菌种实验的数据统计：

表5：乳白色菌种实验数据统计表

⑵乳黄色菌种实验数据：

以下为乳黄色菌种实验的数据统计：

表6：乳黄色菌种实验数据统计表

实验总结：

1、乳白色菌种在该杀菌剂体系下存活短，只能存活1天。

2、乳黄色菌种在该杀菌剂体系下存活周期长，当细菌含量在10^4cfu/mL时，可存活8天，当细菌含量为5000cfu/mL时，可以存活6天，杀菌剂含量基本未发生改变；相较于乳白色菌种，乳黄色菌种杀菌剂耐受性更强。

4.6.2 存储温度的影响

⑴30℃存储条件下实验数据：

以下为30℃存储条件下实验的数据统计：

表6：30℃存储条件的实验数据统计表

⑵20℃存储条件下实验数据：

以下为20℃存储条件下实验的数据统计：

表7：20℃存储条件的实验数据统计表

实验总结：

1、当乳液在30℃储存时，杀菌剂对细菌的抑制作用更明显；当细菌含量在10^4cfu/mL时，只可存活6天，当细菌含量为5000cfu/mL时，可以存活2天，杀菌剂含量基本未发生改变；

2、相较于30℃储存时，20℃储存时细菌存活周期增加，最长为8天，在温度低的情况下，细菌在该杀菌剂体系下生存时间增长。

4.6.3 实验优化探究

从上述实验可以看出，杀菌剂残余量基本无变化，初步怀疑可能是可能是乳液中细菌的接种量较小，无法满足实验，因此后续需要增加细菌的接种量在进行实验。同时我们在设计实验室忽略了乳液黏度对实验的影响，因此结合这两点改善进行如下实验。

1 乳液黏度数据收集统计：

在数据收集过程中发现，水性乳液的黏度值不固定，数值在2000~10000mPa.s，实验中未体现出黏度对于乳液中细菌含量和杀菌剂含量之间的影响，需要对高黏和低黏乳液进行实验。

图16：水性乳液黏度数据统计图

2 实验优化：

根据上次实验数据分析，在低黏和高黏体系乳液中增加接种量进行实验改进，数据如下：

1 乳白色菌种实验数据：

表8：乳白色菌种实验数据统计表

2 乳黄色菌种实验数据：

图17：温度条件下黄色菌含量与杀菌剂残留含量矩阵图(低黏体系)

图18：温度条件下黄色菌含量与杀菌剂残留含量矩阵图(高黏体系)

实验总结：

1、乳白色菌种在低黏乳液中接种量达到10^6cfu/mL时，经过2天的时间，乳液中细菌含量变为0，实验再次说明乳白色菌种在该杀菌剂体系下不耐受，不易存活。

2、乳黄色菌种在低黏乳液中接种量达到10^6cfu/mL时，在30℃储存条件下，经过6天的时间，乳液中细菌含量变为0，而20℃储存条件下，乳黄色菌种可以多存活3天，并且乳液中杀菌剂含量基本无变化。

3、乳黄色菌种在高黏乳液中接种量达到10^7cfu/mL时，在20℃储存条件下，经过13天的时间，乳液中细菌含量才会变为0，而30℃储存条件下，乳黄色细菌仍需要10天，并且乳液中杀菌剂含量基本无变化，同时与低黏乳液实验数据比较，高黏乳液中细菌耐受性更强，在相同储存条件下可以多存活4天左右。

4.7 异噻唑啉酮杀菌剂的工作原理研究

根据上述实验发现增加菌种的接种量后，乳液中杀菌剂残留含量基本无变化，因此需要查阅资料研究一下异噻唑啉酮类杀菌剂的工作原理，详细如下：

异噻唑啉酮类杀菌机理：

主要是亲电活性杀菌剂，依靠异噻唑啉酮杂环上的活性部分与细菌体内蛋白质中DNA分子上的碱基形成氢键，并在细菌的细胞上吸附，起到攻击细胞亲核的作用，从而破坏细胞内DNA的结构，使其失去复制能力，丧失相关生理、生化反应以及代谢活动，从而使细胞死亡。异噻唑啉酮衍生物的不同结构使其具有不同的性质特点，支链短的异噻唑啉酮的衍生物水溶性好，为杀细菌剂；支链长的异噻唑啉酮的衍生物水溶性较差，为杀真菌剂。

实验猜想：结合上述实验及异噻唑啉酮类杀菌剂的工作机理猜测，杀菌剂和乳液中细菌的DNA形成氢键后，破坏细菌的复制能力，启到杀死细菌的作用，当细菌被杀死后，异噻唑啉酮类杀菌剂又重新被释放回到乳液中，从理论上佐证了实验结论的可靠性。

5.实验总结

⑴实验中使用的两种菌种，乳黄色菌种对异噻唑啉酮类杀菌剂的耐受性更强。

⑵当乳液存在细菌污染风险时，在实验用的杀菌剂体系中，30℃的存储温度相比于20℃的存储温度，细菌存在时间会变短。