主题：【原创】超声波辅助衍生-QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法快速测定蜂蜜中硝基呋喃类代谢物的残留量

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发表于：2023/02/08 11:37:39 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

超声波辅助衍生-QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法快速测定蜂蜜中硝基呋喃类代谢物的残留量

1.简介

硝基呋喃类药物是人工合成的广谱抗菌药物，主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因４种。硝基呋喃类药物对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌和原虫等病原体具有低浓度抑制，高浓度杀灭的作用。硝基呋喃类药物很不稳定，摄入后在动物机体内快速分解代谢，半衰期为7-63分钟，代谢产物分别为３－氨基－２－唑烷基酮（AOZ）、５－甲基吗啉－３－氨基－２－唑烷基酮（AMOZ）、氨基脲（SEM）和１－氨基乙内酰脲（AHD）。它们的代谢物可以与组织蛋白结合，并在体内停留数周或更长时间。这些代谢物具有致癌、致突变以及损害肺部和心脏肌肉等危害作用，严重威胁着消费者的身体健康。所以通过监测硝基呋喃代谢物的残留量来作为是否非法使用硝基呋喃类药物的依据。

由于硝基呋喃类抗菌药具有效果好、抗菌谱宽、较难产生耐药性，并且价格低廉等优点被广泛用于畜禽以及水产养殖等。鉴于硝基呋喃类代谢物的危害性，欧盟、美国、日本等国家也相继发文禁止其在动物源性食品中使用。我国农业部也于2002年颁布了禁止在动物性饲料中使用硝基呋喃类抗生素的相关法令。

2005年欧盟已在05／573 EC指令中新增蜂蜜中硝基呋喃类代谢物残留的检测为我国出口蜂蜜的必检项目，且将每种硝基呋喃代谢物的最低要求性能水平（MRPL）设定为1 μg /kg，这严重影响着我国蜂蜜的出口,在这种情况下，开发快速、高效、灵敏的硝基呋喃代谢物测定方法对解决食品安全问题非常重要。

通常蜂蜜中呋喃代谢物的前处理步骤时间长，较为耗时，结合态的化合物需用盐酸水解后再用邻硝基苯甲醛(2-NBA)进行恒温振荡衍生大于16 h，再经固相萃取小柱净化，因蜂蜜基质含糖量高、粘稠度大，大大增加了过净化柱时间，最后处理好后供液相色谱-串联质谱法测定。

超声波辅助衍生能有效加快样品中目标化合物的水解和衍生反应速率，大大缩短样品前处理衍生时间，提高检测效率。然而目前超声波辅助衍生技术在测定蜂蜜中呋喃代谢物的应用中未见报道。

尽管LC-MS/MS具有很高的选择性和特异性，但在大多数研究中，含有产生的代谢物衍生物的水解产物需要通过液液萃取（LLE）或固相萃取（SPE）进行额外纯化，以最小化基质干扰和基质效应，而蜂蜜中高糖含量以及色素和酚类物质等会产生较强的基质干扰，同时其粘稠度大、含水量小等也会带来前处理净化时间长，堵柱现象严重等挑战。QuEChERS法以其快速、操作简单、高效等特点近年来广泛应用于复杂基质中的残留物测定。然而，目前很少有研究将QuEChERS技术应用于蜂蜜基质中硝基呋喃代谢物的测定。

吸附剂是这项技术的关键。在传统的QuEChERS中，伯仲胺（PSA）、十八烷基吸附剂（C18）、石墨化炭黑（GCB）、氨基吸附剂（–NH₂）、中性氧化铝（Al₂O₃-N）和弗罗里硅土（florisil）可用于去除有机酸、色素、糖、脂质和脂肪酸的最广泛使用的吸附剂这些吸附剂可单独使用或组合使用，以纯化蜂蜜样品

氧化锆、多壁碳纳米管、氧化锌等作为新型吸附剂，具有良好的化学稳定性，高的比表面积，强的吸附能力和宽的pH值适用范围，均在净化基质提取液方面具有良好的表现。

在本研究中先通过超声波衍生技术衍生，再采用PSA、C18、GCB、–NH2、Al2O3、florisil、ZrO2、MWCNTS和ZnO等九种吸附剂用于测定蜂蜜样品中的硝基呋喃代谢物。该方法包括超声波衍生步骤、QuEChERS提取净化步骤和HPLC–MS/MS分析。最终在一定衍生条件下衍生化后，再使用一定质量比例的PSA和C18净化使基体干扰最小化。在对衍生条件、样品pH、萃取溶剂、萃取盐和滤膜等几个萃取因素进行优化时，采用基质匹配外标法定量得到最优条件。为使结果更准确，最后采用基质匹配内标法进行方法学验证，用于真实蜂蜜样品中的硝基呋喃代谢物残留的测定。

2.材料和方法

2.1. 化学试剂和抗生素

HPLC级甲醇、乙酸乙酯、乙腈、醋酸铵和甲酸；PSA、C18、GCB、–NH₂、Al₂O₃-N、florisil和MWCNTS；二氧化锆（ZrO₂）、氧化锌（ZnO）；邻硝基苯甲醛

分析级盐酸（HCl）、磷酸钾（K₃PO₄）、磷酸氢二钾（K₂HPO₄）、氢氧化钠（NaOH）、氯化钠（NaCl）、

无水硫酸镁（MgSO₄）和无水硫酸钠（Na₂SO₄）。

浓度为1.0 mg/mL的硝基呋喃代谢物混合外标标准品（呋喃唑酮代谢物：3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）、呋喃它酮代谢物：5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮（AMOZ）、呋喃西林代谢物：氨基脲（SEM）、呋喃妥因代谢物：1-氨基-2-内酰脲（AHD））和浓度为100 μg/mL硝基呋喃代谢物混合内标标准品（呋喃唑酮-D4：AOZ-D4、呋喃它酮-D5：AMOZ-D5、呋喃西林-¹³C¹⁵N₂:SEM-¹³C¹⁵N₂、呋喃妥因-¹³C3: AHD-¹³C3）。

2.2. 仪器和条件

样品衍生在超声波清洗仪（上海科导）中进行，功率为53 HZ 、温度为60 ℃、时间60分钟。样品分析在三重四极4500三重四极质谱仪（美国AB Sciex）和LC 30A超高效液相色谱（日本岛津）上进行。使用Analyst®（AB Sciex）软件进行数据采集和处理。使用ChromCoreC18柱（内径2.1mm×150mm，粒径1.8 μm）分离分析物。在0.3 mL/min的恒定流速下，注射体积为5 μL。流动相组成为0.1%甲酸水溶液，含有5 mM醋酸铵（A）和乙腈（B）。

梯度洗脱如下：10.0%B（2.0分钟）、10.0-90.0%B（3.5分钟）、90.0%B（保持2.5分钟）、90.0-10.0%B（0.1分钟）、10.0%B（1.9分钟）。总运行时间为10分钟。柱温保持在40℃

在多反应监测（MRM）中进行质谱分析。选择正离子模式（ESI+）分析目标分析物。优化的电喷雾条件为：幕气，10 psi；离子源气体GS 1，50 psi；离子源气体GS 2，50 psi；离子喷射电压，5500 V；源温度，500℃氮气碰撞气体，中等。表1列出了MRM参数，包括前体离子、产物离子、脱团电位（DP）和碰撞能（CE）。

表1呋喃代谢物的质谱条件

Analyte	Measured ion	Precursor ion (m/z)	Product ion (m/z)	DP/V	CE/eV
AOZ	[M+H]⁺	236.0	134.0*	59	17
AOZ	[M+H]⁺	236.0	104.0	59	26
AMOZ	[M+H]⁺	335.1	291.1*	77	15
AMOZ	[M+H]⁺	335.1	262.1	77	45
SEM	[M+H]⁺	209.1	166.0*	70	14
SEM	[M+H]⁺	209.1	192.0	70	15
AHD	[M+H]⁺	249.0	134.0*	76	17
AHD	[M+H]⁺	249.0	104.0	74	30
AOZ-D4	[M+H]⁺	239.9	679.2*	80	26
AMOZ-D5	[M+H]⁺	340.3	296.1	92	16
SEM-¹³C,¹⁵N2	[M+H]⁺	212.0	168.0	85	14
AHD-¹³C3	[M+H]⁺	252.0	134.0	77	17

*quantitative ion

2.3. 样品制备

为制备样品，将4 g蜂蜜称重至50 mL离心管中，添加适量的混合内标工作液，并添加0.2 mL 0.1mol/L 邻硝基苯甲醛、5 mL 0.2 mol/L盐酸溶液。混合物被旋转并完全溶解，于53 Hz、60 ℃条件下水浴超声波衍生60 min，再用3.0 mL 0.3 mol/L K₃PO₄溶液调pH7.0±0.2后，添加8.0 mL乙腈和4.0 g氯化钠。在剧烈旋转10 min后，然后以3900 rpm的转速离心3分钟。将上清液转移到含有200 mg PSA+100mgC18的干净10 mL离心管中，并旋转混合物3分钟。在3900 rpm下离心3分钟后，通过0.22 μm聚四氟乙烯（PTFE）膜注射器过滤器过滤产生的上清液，并将5 μL滤液注入HPLC–MS/MS系统。

3.结果和讨论

3.1. HPLC-MS/MS的优化

HPLC–MS/MS用于目标化合物的多残留分析，并优化以确定最合适的分离和检测方法。

对于质谱优化，通过流动注射将目标分析物的标准溶液衍生后注入质谱仪。在ESI正模式和负模式下对前体离子进行了全面扫描。结果显示，在ESI正模式下，前体离子的信号更强，碎裂更好。在这种模式下，所有分析物主要形成质子化[M+H]⁺离子。为了实现快速可靠的分离，优化了液相色谱条件。对不同的流动相系统（乙腈-水和甲醇-水）和水添加剂（甲酸和醋酸铵）进行了评估，并对结果进行了比较，以优化分辨率和峰分离。当使用甲醇-水系统时，流动相粘度大、洗脱能力弱，每个峰的保留时间延迟，并且有明显的峰加宽。乙腈-0.1%甲酸水体系对四种目标物的检测显示出良好的灵敏度，且峰型较好。而添加乙酸铵对SEM没什么影响，但会显著改善了AOZ、AHD、AMOZ的响应和峰形状。因此，本研究选择5 mM醋酸铵的0.1%甲酸水-乙腈溶液作为流动相。

3.2. 衍生和提取程序的优化

采用单因素实验评价了以下因素对萃取效率的影响：样品超声波衍生的功率、温度、时间、萃取溶剂的类型和体积、萃取盐的类型和数量、吸附剂的类型和数量以及滤膜的类型。使用空白加标蜂蜜样品对每种分析物在2 μg/kg下的提取条件进行优化，并使用绝对提取回收率（%）来评估提取性能。

蜂蜜中硝基呋喃代谢物与蜂蜜基质呈结合态存在的，因此，添加盐酸溶液以水解样品，破坏目标物与基质的结合，使目标物释放出来呈游离态。由于目标物分子量较小，易溶于水，不便直接测定，故加入邻硝基苯甲醛与水解出来的目标物发生衍生反应后再测定。超声波衍生较常规的恒温振荡衍生在衍生效率方面具有明显的优势，大大缩短了衍生时间。超声波衍生的功率、温度、时间等条件对于衍生化的效率具有很大的影响。在本研究中，我们研究了功率、温度和时间对衍生化的影响（如图1），由图中可知，目标物在功率为53 Hz的衍生效率是35 Hz的衍生效率的3倍；30 ℃~80 ℃条件下，评估温度对衍生效率的影响，结果显示，在30 ℃~60 ℃范围内，随着温度的升高，衍生效率逐渐提升，当继续升高时衍生效率反而下降，这可能是因为温度过高导致衍生物不稳定而发生降解；在功率为53 Hz，温度为60 ℃条件下，评估衍生时间对衍生效率的影响，结果显示，在30 min~60 min范围内，随着时间增加，衍生效率逐渐提升，当继续衍生时衍生效率无明显变化，表明在60 min时目标物能够衍生完全。因此采用功率53 Hz、温度60 ℃衍生60 min时衍生效率最优，相比于传统恒温振荡衍生16 h，衍生效果相当，但是在缩短时间方面有极其明显的优势。

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图1 功率、温度和时间对衍生效率的影响

蜂蜜在用盐酸溶液水解衍生后，需要将样品溶液PH值调节至中性，使目标物呈分子状态，以便于目标物的提取。实验一般会使用2 mol/L NaOH溶液或者1 mol/L K₂HPO₄溶液调节PH值，而2 mol/L NaOH溶液不具缓冲能力，在调节PH时使得溶液的PH值急剧变化，不便于调节；1 mol/L K₂HPO₄溶液具有缓冲能力，但在调节PH值时使用量很大，会影响后面目标物的提取。蜂蜜种类多、基质复杂，不同种类的蜂蜜的弱酸性会有所不同，加入一定量的盐酸水解衍生后的PH值也会有差异，通过比较分析，最终采用3.0 mL 0.3 mol/L K₃PO₄溶液，可将蜂蜜样品溶液PH值调节至7.0±0.2，此种缓冲溶液具有抗不同蜂蜜类别的样品酸性程度不同的作用,同时还有抗稀释的作用。因此，本研究使用3.0 mL 0.3 mol/L K₃PO₄缓冲溶液进行样品PH的调节。

硝基呋喃代谢物本身分子量小，极性很大，易溶于水，难以测定，需要通过与邻硝基苯甲醛发生衍生反应后改变了其极性，让其极性有所减小，以便于提取和进化。本研究选择了甲醇、乙酸乙酯、乙腈三种提取溶剂，以评估它们作为萃取溶剂的性能。甲醇不能与样品溶液形成有效的分离，这意味着它不适合分析。当使用乙酸乙酯作为萃取溶剂时，乙酸乙酯能与样品溶液形成明显的分层，AOZ、SEM和AHD三个目标物的回收率令人满意，范围在82.30%至94.10%之间，但是实验发现AMOZ的回收率为零。乙腈弱溶于糖，可用于沉淀蛋白质，同时能与样品溶液盐析分层。如图2A所示，用乙腈提取的所有目标分析物的回收率均令人满意，范围在85.30%至94.90%之间，其中AOZ、SEM和AHD在乙腈作为萃取溶剂的回收率和乙酸乙酯作为萃取溶剂的回收率相当，但是AMOZ的回收率可以达到87.58%~93.05%，因此选择乙腈作为萃取溶剂。同时在4 mL和16 mL范围内进一步评估乙腈的效果（图2B）。根据结果，8 mL乙腈就足够了，进一步增加乙腈的体积并不能提高回收率。因此，使用8 mL乙腈。

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图2 提取试剂和提取试剂体积对提取效率的影响

在提取过程中乙腈作为有机相提取液与水相互溶，需要添加合适的萃取盐以去除多余的水并增加样品溶液的离子强度，从而改善分析物从水相到有机相的分配。在本研究中，我们研究了单独使用的NaCl、Na₂SO₄和MgSO₄对目标分析物回收率的影响（图3A）。当单独使用NaCl时，获得最佳回收率，所有分析物回收率均在80%以上。与其他提取盐相比，使用NaCl显著提高了AOZ、AMOZ、SEM和AHD四种目标物的回收率。

如图3B所示，当添加2 g NaCl时，所有分析物回收率都很低，这可能是因为添加的NaCl量较少，溶液离子强度弱，水相和有机相不能很好的分层，分析物的扩散系数小，目标物不能完全进入有机相，最后导致萃取效率低。随着NaCl量的增加，大多数分析物的回收率在一定程度上增加。当添加到6 g NaCl时，所有分析物的回收率没有明显的变化。优化后，4 g NaCl被认为足以实现良好的提取。

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图3 不同盐析剂及其量对提取效率的影响

吸附剂成分可以被认为是QuEChERS技术的核心，因为它影响干扰物质的去除和分析物的最大保留。总的来说，PSA与–NH2类似，均可用于去除脂肪酸、有机酸、部分色素、金属离子和糖类，但PSA含有两个氨基，具有更大的离子交换容量；Florisil是一种强极性、高活性的多孔吸附剂，可吸附低极性和中等极性物质；C18以十八烷基硅胶为填料，主要去除非极性化合物；Al₂O₃-N吸附剂表面有弱碱性。可以作为极性吸附剂，对酸性碱性分析物有不同的选择性；GCB和MWCNTS均具有高比表面积、反相和离子交换双重保留机制，对非极性化合物、强极性化合物、金属离子等均有较好的吸附，特别是在作用于色素和平面结构化合物等方面表现较好；ZrO₂的高稳定性、惰性强，在吸附金属离子、磷酸盐类、脂类等应用较多；ZnO既有极性表面又有非极性表面，不同的表面具有不同的分子吸附性能。其在去除蜂蜜中糖类表现良好。

根据我们的研究结果，PSA、C18、GCB、–NH₂、Al₂O₃-N、florisil、ZrO₂、MWCNTS和ZnO九种吸附剂单独使用时表现出来的情况均不同（图4A）。GCB、–NH₂、MWCNTS的回收率最低，均小于45%，Al₂O₃-N、florisil、ZrO2、ZnO的回收率均小于65%；PSA、C18单独使用时的回收率均大于70%，其中PAS回收率表现最好，为80%，可能是因为蜂蜜中含有丰富的糖类，其中包含葡萄糖和果糖，PSA对极性化合物、糖类具有很好的吸附效果，同时对目标物吸附少。

随后研究了PSA用量对分析物回收率的影响（图4B）。PSA含量从50mg增加到200 mg，导致所有分析物的峰面积增加。然而，当添加250 mg PSA时，峰面积减小。这些结果表明，过量吸附剂可能导致吸附目标物从而使回收率降低。因此，PSA的最佳用量为200 mg。

根据单独使用C18时各目标物回收率来看，可能是因为C18能够有效祛除了基质中蜂蜡、脂溶性维生素等非极性化合物从而使各目标物回收率均大于70%虽然单独使用200 mgPSA时，目标物的回收率表现良好且满足要求，我们考虑用C18的吸附非极性化合物的特性来弥补PSA只吸附极性化合物的缺点，以达到比单独使用200 mgPSA时更好的净化效果、更高的回收率。

于是我们进一步研究了200 mgPSA搭配不同含量的C18作为净化剂对分析物回收率的影响（图3C）。当C18含量从50 mg增加到100 mg，导致所有分析物的峰面积增加,回收率提升到90%左右。然而，当添加150 mg C18时，峰面积开始减小，这些结果表明，加入过量C18吸附剂可能导致分散性差或吸附目标物，最终使回收率降低。因此，本研究最终选择200 mgPSA+100 mgC18。

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图4 吸附剂种类及其量对效率的影响

3.3. 方法验证

实验采用基质匹配外标法定量，对衍生条件、样品pH、萃取溶剂、萃取盐和滤膜等几个萃取因素进行优化，得到最优条件后，为使结果更准确，采用基质匹配内标法进行方法学验证，方法验证按照中华人民共和国国家标准和欧洲SANTE 11813/2017进行。线性回归方程、线性范围、LOD、LOQ和MEs如表2所示，通过对各条件优化后四种浓度水平下的准确度和精密度如表3所示。

4.结论

我们开发并验证了一种操作简单、快速、成本低廉的方法，结合HPLC–MS/MS同时测定蜂蜜中四种硝基呋喃代谢物残留。在本研究中，首次将超声波技术用于蜂蜜样品中硝基呋喃代谢物的衍生，大大缩短了衍生时间，同时运用改进的QuEChERS技术对目标物进行提取净化，在优化的色谱和质谱条件下，回收率在98.0-107.8%之间，RSD在1.95%到7.89%。该方法适用于蜂蜜样品中四种硝基呋喃代谢物残留的常规监测，为蜂蜜的安全保障提供一定技术支持。

表2 蜂蜜样品中硝基呋喃代谢物的线性范围、基质标曲、LODs和LOQs

Analyte	Linearrange(ng/mL)	Calibration equations	r	LOD(μg/kg)	LOQ(μg/kg)	ME-ISTD	ME-ESTD
AOZ	0.25-20	Y = 0.078X-0.00283	0.9999	0.15	0.5	1.02	1.79
AMOZ	0.25-20	Y =3.22X+0.0317	0.9999	0.15	0.5	1.06	0.83
SEM	0.25-20	Y =0.0664X+0.000748	0.9999	0.15	0.5	0.93	1.96
AHD	0.25-20	Y = 0.203X-0.000975	0.9999	0.15	0.5	1.02	1.56

表3 空白蜂蜜样品中硝基呋喃代谢物加标的回收率和精密度(n = 6)

	0.5 (μg/kg)		1.0 (μg/kg)		2.0 (μg/kg)		4.0 (μg/kg)		Inter-day		Intra-day
Analyte	Recovery%	RSD %	Recovery%	RSD %	Recovery%	RSD %	Recovery%	RSD %	Recovery%	RSD %	Recovery%	RSD %
AOZ	107.4%	6.85%	105.7%	4.52%	103.7%	2.27%	100.7%	1.95%	100.2%	3.56%	98.7%	3.09%
AMOZ	106.6%	7.02%	104.7%	5.32%	105.1%	5.04%	100.5%	5.45%	98.5%	5.19%	93.7%	5.05%
SEM	98.3%	3.03%	100.4%	4.23%	100.4%	5.89%	98.0%	7.89%	96.4%	5.29%	97.8%	5.13%
AHD	101.7%	3.14%	107.8%	3.56%	104.4%	3.19%	105.0%	6.26%	96.0%	4.65%	93.2%	3.98%