主题：【分享】质谱技术在临床微生物样本直接检测中的应用-2

(二)MALDI-TOF MS分析

　　目前主要有4种MALDI-TOF MS系统[9]:MALDI Biotyper系统 (Bruker Daltonics, 德国), VITEK MS系统 (BioMé rieux, Marcy l’ Etoile, 法国), the AXIMA@SARAMIS 数据库 (AnagnosTec, 德国)和the Andromas (Andromas, 法国), 其中前2种质谱系统已获得中国食品和药品监督管理局许可证, 可以用于临床样本的检测。

　　在进行质谱分析前, 应根据不同的检测对象和使用的激光类型选择合适的基质。基质由基质复合物和基质溶剂组成。常用溶剂有:乙醇、乙腈和一种强酸如三氟乙酸、甲酸等。常用的基质是2, 5-二羟基苯甲酸(2, 5-dihydroxybenzoic acid, DHB)、ɑ -氰基-4-羟基肉桂酸(ɑ -cyano-4-hydroxycinnamic acid, ɑ -CHCA)、3, 5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(sinapinic acid, SA)等。将经过提取的微生物样本细胞内容物与等量的基质溶液(通常是1 μ L)混合或分别点加在样本靶板上, 待室温条件下干燥后(使得样本与基质共结晶)上机检测即可。

(三)鉴定结果分析

　　将质谱检测得到的谱峰与数据库进行模式匹配, 得到一个鉴定分数。基于软件给出的在列表中第1种微生物的鉴定分数, 根据各自质谱分析系统的判断标准得出检测结果。目前文献报道有2种判断标准:第1种是由STEVENSON等[10]提出的, 鉴定结果按照匹配程度进行打分, 分值在0~3之间。当得到的鉴定分数≥ 2.0时, 表示待测菌株有较大的把握被鉴定到种的水平; 鉴定分数在1.7和2.0之间时, 表示菌株被鉴定到属的水平, 分值< 1.7表示产生的鉴定结果不可信。第2种标准是LA SCOLA等[11]提出的, 当一个样本经过4次点样鉴定, 当列表中第1种微生物的鉴定结果均一致, 并且至少2次的鉴定结果鉴定分数≥ 1.900, 或者4次的鉴定分数均≥ 1.200, 表明微生物能被正确鉴定。有学者发现通过改进上述的鉴定标准可以得到更好的鉴定效果, ROSSELLó 等[12]认为在临床样本直接鉴定时, 鉴定分数要比直接纯培养的低, 可能会对分析结果造成干扰, 而厂商推荐的鉴定标准有些严格, 只有得到很高的鉴定分数结果才是被接受的。因此提出新的标准增加可接受的准确鉴定数:当一个样本4次点样中至少有2次的鉴定结果一致, 并且对列表中的第1个微生物种的鉴定分数均≥ 1.4时, 即表示能够准确鉴定, 这种标准与纯培养的鉴定结果有100%的符合率。NONNEMANN等[5]、GORTON等[13]将种的鉴定分数降到1.5, 可以将种的鉴定率从56%提升到76%、54%提升到63%。以上均提示了厂商推荐的cut-off值比较保守, 使得鉴定的敏感性降低。此外, 由于目前的数据库尚不完善, 对于部分菌株可能会出现鉴定失误的情况, 实验室工作人员应在商品数据库的基础上建立和丰富自己的参考数据库, 以提升鉴定的准确率。

三、MALDI-TOF MS在临床样本直接检测中的应用

　　从临床样本直接检测微生物可以节省转种培养的时间。目前已取得显著进展的是从血培养阳性样本中直接检测细菌和酵母样真菌, 而从中段尿和其他无菌体液样本中的直接检测也在快速发展。

(一)血流感染病原菌的快速检测

　　血流感染的发病率和死亡率都相当高, 快速准确的血流感染病原菌鉴定对于临床抗菌药物的合理使用和病愈率的提高至关重要。直接检测能显著减少鉴定时间(< 29 h), 使得在血培养阳性的第1个24 h内接受适当抗菌药物治疗的患者增加11%[14]。CLERC等[15]认为基于MALDI-TOF MS 对血培养阳性样本的检测可能会成为血培养阳性患者管理中除了革兰染色报告之外的第2个关键步骤。近年来, 有不少的研究应用MALDI-TOF MS直接鉴定临床微生物样本, 取得明显进展的是从血培养阳性样本中直接鉴定细菌和酵母样真菌[5, 10, 16], 而混合菌和厌氧菌等的鉴定还有待更多的研究。

1.鉴定效能 (1)细菌:在引起血流感染常见菌的鉴定方面, MALDI-TOF MS技术已经在肠杆菌科细菌、葡萄球菌等病原菌的直接鉴定方面取得了很好的鉴定结果。大量的研究评估了MALDI-TOF MS用于直接鉴定阳性血培养瓶的表现, 不同文献报道的种水平的鉴定率在54%~99%不等[5, 10, 11, 17, 18, 19], 主要是由于所鉴定细菌种类/数量的不同, 或是运用了不同的预处理/提取方法, 或是定义了不同的cut-off值。SCHMIDT等[19]、SCHUBERT等[20]应用不同的操作程序直接鉴定阳性血培养瓶样本, 结果显示103株代表临床最常见的13个属24个种的样本中, MALDI-TOF MS准确鉴定其中的72%(86.6%革兰阴性菌, 60.0%革兰阳性菌); 500例样本中, 其中革兰阳性菌358例, 革兰阴性菌98例, 总体种的鉴定率达到了86.5%, 其中革兰阳性菌是89.8%, 革兰阴性菌是86.3%。国内最新的研究也显示, 陈峰等[21]运用分离胶促凝管联合MALDI-TOF MS直接检测, 革兰阴性菌和革兰阳性菌中有84.0%和75.0%能被准确鉴定到种的水平; 对于血流感染中最常见的病原菌的菌种鉴定符合率达到83.3%~96.9%。以上研究均显示了MALDI-TOF MS在血流感染直接鉴定方面的良好表现, 并呈现出了如下特点:对革兰阴性菌的鉴定率比革兰阳性菌高; 无荚膜的细菌较有荚膜的细菌(细胞壁难以破坏提取到足够的菌体蛋白)的鉴定率高; 混合细菌感染时鉴定能力有限, 多数情况下只能鉴定出其中一种优势细菌; 对草绿色链球菌的鉴定效果较差(鉴定不出, 或将缓症链球菌鉴定为肺炎链球菌)[10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20], 需要进行另外的确证试验; (2)真菌:MALDI-TOF MS在鉴定酵母菌方面有较高的鉴定率。FERRONI等[18]、YAN等[16]的研究表明酵母菌鉴定的正确率可达91%~100%。但是也有学者得到了相反的结果, GORTON等[13]和PAOLUCCI等[22]直接鉴定的正确率只有56%和41%, 可能是因为鉴定使用的血量过少(1.5 mL), 或是在处理样本的过程中样本的丢失导致了低鉴定率; (3)其它细菌:目前关于厌氧菌的直接鉴定的报道较少, 并且显示了鉴定成功率并不理想, 可能是因为厌氧菌对生长条件的要求较为苛刻, 导致增菌的数量达不到要求, 还需要更多的研究来优化其鉴定条件。

2.不同的检测方法 上述结果均是MALDI-TOF MS直接检测报阳血培养瓶的样本所得到的。有研究表明报阳血培养瓶的样本也可以转种到固体培养基上进行短暂孵育(如2~4 h)后再进行鉴定, 则具有更大的优势。KROUMOVA等[23]在质谱法分析实施蛋白提取程序之前, 将样本富集到一个增菌培养基中孵育大约2 h后再进行质谱分析, 同时达到增菌和减少血液成分干扰的目的, 提升了鉴定分数, 使鉴定结果更可信; IDELEVICH等[24]将血培养阳性的样本转种到血平板孵育1.5、2、3、4、5、6、7、8、12和 24 h(对照), 分别直接进行MALDI-TOF MS检测, 直到有可靠的到种水平的鉴定结果出现(鉴定分数≥ 2.0), 结果发现革兰阳性球菌平均鉴定到种所需要的孵育时间是5.9 h, 革兰阴性杆菌平均鉴定到种所需要的孵育时间是2 h。如果增加了蛋白提取程序, 革兰阳性球菌的孵育时间将缩短至3.1 h, 但对革兰阴性杆菌的影响不明显。这种方法可以有效地减少额外的人工操作时间和费用。HONG等[25]的研究也表明, 这种方法能得到可靠的鉴定结果(与传统生化方法的属水平的一致率是98.9%), 并且这种方法不会受血培养系统的影响, 成本低, 易于操作。

3.与药物敏感性联合检测 为了克服MALDI-TOF MS不能做体外药物敏感性试验的不足, MALDI-TOF MS已经开始与药物敏感性试验联合用来直接检测阳性血培养瓶的样本[26], 用不含活性炭的血培养基在过滤和洗涤之前用溶解细胞的缓冲液进行孵育, 然后将从过滤膜上收集的微生物直接进行MALDI-TOF MS分析, 剩下的样本用VITEK 2系统孵育并进行药物敏感性试验, 将94.0%的样本鉴定到了种的水平, 药物敏感性试验与传统方法相比有93.5%的一致率, 并且相较于传统的56.3 h, 新方法鉴定和药物敏感性试验所用的时间缩短到了11.4 h。证明了在一天内完成微生物鉴定和药物敏感性试验的可行性。为获得更好的治疗争取了时间并且减少了住院的费用[27]。

4.检测结果的影响因素 有研究指出不同的血培养瓶和血培养系统可能会产生鉴定结果的差异[19, 28, 29]:使用含有活性炭的血培养瓶和BacT/ALERT血培养系统的鉴定率较低, 使用含有树脂的血培养瓶和BACTECTM血培养系统鉴定率较高。其中一项研究比较了含有活性炭的和不含活性炭的血培养瓶在BacT/ALERT血培养系统下的鉴定表现, 发现使用不含活性炭的血培养瓶的MALDI-TOF MS的鉴定率为30%, 而含有活性炭的血培养瓶的鉴定率只有8%[28]。而另一项研究比较了3种不同的血培养系统— — BACTECTM, VERSATREK和BacT/ALERT对鉴定率的影响, 经这些鉴定系统培养的阳性血培养瓶的鉴定成功率分别是76%、69%和62%[29]。此外, 使用不同的细菌蛋白提取程序也会影响鉴定成功率[11]。