主题：【已应助】hilic亲水柱使用有什么注意事项：

HILIC亲水作用色谱柱的使用及维护方法
　　在选择HILIC亲水作用色谱柱之前，先多了解自己的样品和杂质，他们的类型结构、极性、酸碱性、分子量大小等。
　　1.样品是极性的且弱酸性的；就可以选择C18在100%酸性水溶液条件下检测，即要选择承受100%纯水且对极性化合物保留很好的HILIC亲水作用色谱柱。
　　2.如果样品极性太强，或酸性太强；可以选择CN，NH2，或硅胶柱，HILIC（亲水色谱），也有使用C18 强阴离子对试剂或强阴离子交换HILIC亲水作用色谱柱（缺点是离子对试剂平衡时间长，对流动相pH要求比较精密，否则很难重复实验，另外离子对试剂很难洗下来，基本上用了离子对的HILIC亲水作用色谱柱就不能再用于其它实验）。
　　3.若样品是碱性的；可选择高纯硅胶柱（高纯硅胶缺少金属杂质，且硅胶端基封尾）或一些经过修饰的C18柱（如极性嵌入技术或碱去活技术等），他们都会减少碱性化合物的拖尾，一般会选择中性或偏碱的条件下做，因为这样可增加碱性样品的保留。
　　4.如果碱性化合物的极性太强，或碱性太强；可以选择宽pH的C18色谱柱在高pH值检测（优点是方法开发简单，缺点是目前实现这一技术的色谱柱品牌比较少，价格也高）或者选用HILIC色谱柱（硅胶柱在反相条件下使用，这也是很经典的检测碱性样品的方法）选择强离子交换柱（缺点是不能用来分析其它样品，对流动相pH要求比较精密，否则很难重复实验）也有使用C18 强阴离子对试剂或强阴离子交换HILIC亲水作用色谱柱。

亲水作用（Hilic）色谱，有时被称为“含水正相色谱”，有时又被称为“反反相色谱”，简单来说，是极性的固定相和极性的流动相组成，亲水相互作用色谱柱可分离极性至高极性化合物，这些化合物在传统的反相液相色谱分离中保留性较差。高度正交的现代化 HILIC 固定相具有较短的平衡时间和极高的效率，可帮助您实现可重现的快速 HILIC 色谱分析。
想要搞懂Hilic色谱柱，首先要明白Hilic的流动相和固定相。

1、流动相

在大多数的Hilic分离中，采用的流动相为含有少量水/缓冲液与有机相混合（典型的是乙腈），水的比例为3%-40%之间。

水的比例不低于3%是由于Hilic色谱的保留机理决定的，普遍认为Hilic色谱流动相中的水会被吸附到极性固定相的表面形成水膜，然后分析物在水膜和流动相之间进行液液分配作用，加上极性官能团和固定相之间的氢键作用力，离子官能团之间的静电作用力等，实现被分析物的保留。水膜的作用非常重要，所以Hilic流动相中至少含有3%的水。当水的比例大于40%时，保留一般很弱（k≈0）。

2、固定相

应用于Hilic色谱的固定相有：纯硅胶柱、氨基柱、二醇基柱、酰胺基柱等。纯硅胶柱有固定相不易流失的优点，在使用CAD、ELSD和LC-MS检测器时，最受欢迎；氨基柱，在Hilic色谱中的应用，特别适合碳水化合物（糖类）分离；二醇基柱，亲水性很好，可以提供不同的选择性。

Hilic和正相色谱相比

1、固定相的区别

同样是Silica，NH2，Diol柱，与用于正相色谱中的色谱柱不同，专为Hilic色谱设计的色谱柱，可以用于水/有机物的流动相中，换句话说，Hilic色谱对固定相的耐水性要求更高，否则会因固定相的水解，出现基线噪音大、色谱柱寿命短等问题。所以用于正相色谱中的色谱柱，不一定能用于Hilic色谱。而适用于Hilic色谱的色谱柱，可以用于正相色谱中。

2、应用范围的差异

正相色谱主要用于极性大的脂溶性化合物，而Hilic色谱主要用于极性大的水溶性化合物。

3、总结

和正相色谱相比，用于Hilic色谱中的Silica/NH2/Diol等色谱柱耐水性更好，Athena NH2-RP在Hilic色谱糖类分析中表现优异。

对于极性强的化合物，如果在正己烷、异丙醇中溶解度较好，推荐用正相色谱，如果在水中溶解度较好，推荐用Hilic色谱。



Hilic和反相色谱相比

1、保留行为差异

和反相色谱相比，Hilic色谱对极性大的水溶性化合物保留能力更强。极性较强的尿素，在Athena C18-WP (LAEQ-462572)没有保留，而在Athena NH2-RP (LAEQ-462568)可以很好的保留。

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2、流动相中水的洗脱强度

以Athena NH2-RP 4.6 × 250mm，5μm （LAEQ-462568）对糖类物质的分析为例。

流动相：乙腈/水（75：25）

色谱峰：1.果糖 2.葡萄糖 3.蔗糖 4.麦芽糖

应用：蜂蜜 中国药典2020年版一部 P374

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流动相：乙腈/水（70：30）

色谱峰：1.蔗糖 2.乳糖

应用：乳糖 中国药典2020年版四部 P690

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对比蜂蜜和乳糖应用，采用同一支Athena NH2-RP 4.6 × 250mm，5μm （LAEQ-462568）色谱柱，流动相从乙腈/水（75：25）变为乙腈/水（70：30）后，蔗糖的出峰时间从14.008min缩短至8.840min，流动相中水相比例增加，目标化合物出峰变早。我们知道，反相色谱中，流动相中水相比例增加，目标化合物的出峰会变晚。在Hilic色谱中，流动相中的水相部分表现为强溶剂，这和传统的反相色谱完全相反。



3、总结

对于极性大的亲水性化合物，在反相色谱中很难保留，可以用Hilic色谱增加保留。

在反相色谱中，流动相中的水相部分表现为弱溶剂，而在Hilic色谱中，水表现为强溶剂。

表1 反相、正相、Hilic色谱对比



Hilic色谱作为正相和反相色谱的补充，采用极性的固定相和流动相，在分析极性强的水溶性化合物中有很大优势。

通常情况，流动相中水相比例为3%-40%，水相比例太高，一方面目标化合物保留太弱，另一方面加快键合相的水解。

固定相的耐水解性要求更高，如Athena NH2-RP在Hilic色谱中特别适合糖类物质的分析，基线噪音小，色谱柱寿命长。

HILIC 色谱柱的使用注意事项

1、HILIC 色谱柱的平衡

使用 50 倍柱体积的 50/50 的乙腈/水相缓冲溶液（缓冲液的最终浓度为 10mM）平衡新色谱柱。

在开始进样前，用 20 倍柱体积的起始流动相平衡色谱柱。

进行梯度分析时，进样间隔需要用 10 倍柱体积起始流动相平衡色谱柱，色谱柱平衡不充分将导致保留时间漂移。

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2、HILIC 流动相需要注意的问题
流动相中总是至少保持 5％的极性溶剂（如 5％水相缓冲液，5％甲醇或 3％甲醇+2%水相缓冲液等），保证 HILIC 硅胶填料始终被水浸润。
在流动相或梯度中至少保持有机溶剂（如乙腈）的比例不低于 40％。
不要使用磷酸盐缓冲溶液体系，因为磷酸盐缓冲液在 HILIC 色谱模式下会析出；使用磷酸则没有问题。
甲酸铵或乙酸铵水溶液缓冲系统比甲酸或乙酸的水溶液重现性更好。如果不能使用缓冲液而一定要使用流动相添加剂如甲酸，最好使用 0.2%的浓度而非 0.1%。
为得到最好的峰形，在流动相或梯度中总是保持缓冲系统的浓度为 10mM。

3、HILIC 稀释剂需要注意的问题
如果可能，尽量用 100％乙腈溶解样品进样。避免使用水配制样品溶液，请选择较弱的 HILIC 溶剂，如乙腈、甲醇、异丙醇等配制样品溶液。
最常用的稀释剂为 75/25 乙腈/甲醇，这个体系充分平衡了样品的溶解度和峰形两个因素。
不要用水或 DMSO 做稀释剂，它们将导致峰形变得很差。
使用反相 SPE 技术将水或 DMSO 置换成乙腈再进样。如果不能这样操作，用有机溶剂稀释水或 DMSO。
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4、其它有关使用 HILIC 的建议
开始时可以运行一个 95％乙腈至 50％乙腈的梯度，如果样品不保留，使用 95/3/2的乙腈/甲醇/水相缓冲溶液的流动相进行等度分析。
将流动相中的水换成甲醇、丙酮或异丙醇也可以增加极性化合物的保留。
请确保洗针溶剂/冲洗溶剂包含和流动相一样的高比例有机相，否则峰形会受到影响。

5、色谱柱清洗 、 再生和保存
（1）清洗和再生。压力骤然升高，保留时间或分离度发生波动往往表明色谱柱被污染了。可根据如下操作清洗色谱柱。
用 50/50 的乙腈/水清洗以去除极性污染物。如果清洗无效，可用 5:95 的乙腈/水清洗色谱柱。
如果系统压力上升至超过设定的压力限或者突然出现色谱峰分叉，通常是需要更换保护柱的信号。

（2）色谱柱的保存。如果较长时间内不使用色谱柱，请将柱子保存在 95％乙腈中；不要将色谱柱保存在缓冲盐流动相中，如果流动相中含有缓冲盐，先用 10 倍柱体积的 HPLC 级水清洗色谱柱然后换上 95％乙腈保存。如果中间不用水“过渡”清洗有可能在使用 95％乙腈时造成盐 析出。

hilic模式的柱子不建议用大比例水相长时间运行，其他没什么。

附件中有HILLIC模式色谱柱使用注意事项，楼主可以参考下