主题:【资料】抗体标记的方法及注意事项有哪些?

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什么是抗体结合?抗体结合也被称为抗体标记,是一种可将特定标记物共价连接到抗体分子上的抗体修饰技术。这些标记抗体可用于从细胞,组织,或者整个个体的混合物中分离和纯化的目的蛋白。



辣根过氧化酶(HRP)是最常见的抗体酶标记类型。HRP上仅有6个赖氨酸,而且它们的修饰并没有较多的影响酶活性。常见的荧光染料有FITCPEAPCPerCP等,均可用于标记抗体。



除了为客户提供抗体开发,义翘神州还可以提供抗体标记服务,可提供的标记物包括HRP、生物素、荧光基团等。





标记方法:



1)标记抗体、抗原:常用于标记抗体的活化生物是BNHS;对于偏酸性的抗原,标记时多采用BHZ

2)标记酶:以生物素标记HRP为例。



标记注意事项:



1. 待标记物的蛋白浓度不能过低,如若浓度过低需经超滤浓缩等手段提高浓度至0.1mg/mL以上。



2. 一个蛋白质可能被多个生物素标记,标记时,生物素与待标记物应有合适的比例,确保标记后不影响待标记物的活性。推荐生物素:抗原蛋白比例为1~31,生物素:抗体比例为5~201或根据标记试剂盒说明书推荐比例。



3. 为减少空间位阻影响,基于检测灵敏度特异性等要求,可在生物素与被标记物之间加入交联臂结构。



4. 如果偶联基团为氨基,待标记物的系统不得含有游离的氨基(Tris,氨基酸)、载体蛋白(BSA)或者其他干扰物,若有干扰物需要用标记缓冲液反复超滤确保其去除干净,若采用其他基团偶联试剂,待标记物系统亦不能有含对应的游离基团的物质。



5. 如果待标记物为分子量较小的物质,在纯化过程中注意超滤管、脱盐柱、透析袋的截留分子量。



6. 标记反应后的体积量至少在100μL以上,以达到纯化时的最小上样量。



7. 标记反应完成后(氨基偶联体系),可在体系中加入适量的含游离含氨基小分子物质,中和游离的生物素活化试剂,提高纯化效率,减少后续反应的假阳性和高背景。



8. 纯化后的标记蛋白可采用A280BCA法测定蛋白含量。



9. 标记纯化后的蛋白可根据蛋白性质进行分装长期保存,减少冻融次数。



更多抗体标记详情可以参考:https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/antibody-conjugation



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