主题：【转帖】药品含量测定方法设计中的几个问题

◆ 制剂：选用方法时应考虑辅料等的干扰，首选方法一般为HPLC法，在有关物质、辅料不干扰的情况下，也可选用UV法或原料药项下的容量法，复方制剂首选HPLC法较为适宜。

    ◆方法的验证： 订入质量标准的含量测定法不同于一般质量考察的方法，须经过严格的方法学验证，不同原理的测定法具有不同的验证内容及要求：

    (1)容量分析法的验证：①精密度：用原料药精制品考察方法精密度，平行试验5个样本的RSD≤0.2%；②准确度：以测定原料精制品(含量>99.5%)的回收率(测定值与理论值的比值)计算，应在99.7%～100.3%之间(n＝5,RSD≤0.1%)；③滴定终点确定的依据：包括滴定曲线的绘制，如用指示剂法确定终点，应用电位法校准终点颜色，提供指示剂颜色与电位变化情况的对比结果；④耐用性：考察测定条件(供试液稳定性、样品提取次数、时间等)有微小变动时，测定结果不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻时则应在方法中注明。

    (2)HPLC法的验证：①精密度：RSD≤2%(n＝5)；②准确度：用于制剂时，要考察辅料的影响，将一定量药物加到按处方比例配制的辅料中(为标示量的80%～120%)制成高、中、低三个剂量，混合均匀后，每个剂量取三份样品，按拟定方法测定回收率，应在98%～102%之间(n＝9, RSD≤2%)。③线性范围：用已知含量的精制品配制一系列浓度的溶液(n＝5～7)，用浓度C对峰面积A或峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理，线性方程的相关系数r≥0.999，截距应趋于零，并提供线性关系图；④专属性：辅料、有关物质或降解产物峰对主药峰应无干扰；⑤耐用性：考察测定条件(供试液稳定性、流动相组成和pH值、不同品牌或批号的同类色谱柱、柱温、流速、样品提取次数、时间等)有微小变动时，测定结果不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻时则应在方法中注明；⑥灵敏度：作为常量分析法，此项可不作主要要求。

    (3)UV法的验证：①精密度：RSD≤1%(n＝5)；②准确度：方法同HPLC法，回收率应在98%～102%之间(n＝9, RSD≤2%)，同时要求辅料、有关物质或降解产物在测定波长处无吸收。③线性范围：用已知含量的精制品配制一系列浓度的溶液(n＝5～7，吸收度A在0.2～0.7间)，用浓度C对峰面积A或峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理，线性方程的相关系数r应≥0.999，截距应趋于零，并提供线性关系图；④耐用性：考察测定条件(供试液稳定性、样品提取次数、时间、比色法中显色剂用量、反应温度、时间、pH值等)有微小变动时，测定结果不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻时则应在方法中注明；⑤灵敏度：作为常量分析法，此项可不作主要要求。

    吸收度A在0.2～0.8间其线形关系好，利用标准品建立标准曲线后，受测溶液做适当的稀释，使其吸收度在0.2～0.8，如果太小或太大，都将影响测定的准确性的。

    不少文献，用UV法测定药物的含量，一般都把空白辅料作个扫描，如果相对药物而言，没有较大的吸收，就用辅料作空白，测药物的含量，在DXY的其它帖子上看到，UV法测药物的含量时，好像要证明辅料，降解产物没有吸收. 那么我想问问，这些文献统统没有对 降解产物的吸收进行考察，道理何在阿，请前辈指教。UV法测药物含量，方法学考察一般要怎么进行阿？

    如果降解产物有紫外吸收，则影响了主成分的含量测定。使检测结果不能完全代表其含量，所以在不知道降解产物有没有干扰的情况下，还是不用UV的好。

    如果你做新产品开发，那么我建议你一般不要采用uv法测定物质的含量，最好用hplc法替代，这样审评不容易提意见。

    如果是仿制品种原来的方法是uv法测定物质的含量，那么可以考虑用uv法测定。 一般难以对降解产物的吸收情况进行考察，那么可以不考察。那么有关物质的限度要尽可能的低，即使有干扰，也在规定的范围内，可以忽略不计。

    我还想问问,药典中好的剂型,用UV进行药物含量的测量.那么这能说明降解产物对测量没有干扰吗

    药典中的药物含量测定用UV法，是经过方法学验证过的，但不能说降解产物对测量完全没有干扰，应该说在含量测定影响的范围之内。

    您的问题怎么说呢，虽然是药典但是怀疑的态度是必须的。

药典的很多品种都是在很多年前制定的，受到当时的条件制约，制定的方法肯定会存在些问题。

    我来说几句，供参考：

    1.辅料是不能有(至少在测定波长附近不能有)干扰吸收的，即使你做了辅料吸收的扣减，但别人无法重复，因为他不能精确复现你的辅料的配比等等，药检所也不会为了测定你的药品而专门购买辅料吧？

    2.因为UV吸收是基于共轭结构的，只要基本的共轭结构改变不大，其余的改变(降解)可能使吸收峰位置偏移，但一般不足以偏移得在原有吸收的地方不再有吸收。因此降解产物在含量测定波长有吸收是常见的，也是允许的。它对含量测定的影响可以通过增加药品控制指标来制约，一般在这种情况下会对降解产物(也可称为有关物质)制定测定项目。例如有关物质不超过1%，它对含量的影响一般也小于1%，而制剂的含量是有一个范围的如±5%。只有两者都符合规定，才可能达到安全有效的控制目的。

    3.有关物质包括原料生产中带入的中间体、异构体、副反应产物等等，也包括降解产物，采用HPLC或其他有分离过程的定量方法是受到广泛认可的。但我认为不要走到淘汰UV光度法的极端，只要能控制质量，简便快速的UV光度法应该有一席之地。

    我想单纯的UV法测含量会慢慢被淘汰的!比如说一个样品有光学异构的，UV法无法测准它的含量，因为它们在同一个地方有同样的吸收!!另外，在制剂中，UV无法避免辅料和有关物质的干扰!虽然我说的有点极端，但都是事实!大家认为呢？

    我这也有，做个补充。

    含量测定方法的评价(Analytical performance parameters)

    任何一种分析测定方法，根据其使用的对象和要求，都应有相应的效能指标。一般常用的分析效能评价指标包括：精密度、准确度、检测限、定量限、选择性、线性与范围、重现性、耐用性等；测定方法的效能指标可以作为对分析测定方法的评价尺度也可以作为建立新的测定方法的实验研究依据。

    a、精密度(precision)

    系指用该法测定同一匀质样品的一组测量值彼此符合的程度。它们越接近就越精密。在药物分析中，常用 标准(偏)差(standard deviation，SD或S)； 相对标准(偏)差(relative standard

    deviation，RSD)，也称变异系数(coefficient of variation，CV)，表示。

    生物样品分析时，常用RSD表示精密度，并可细分为批内(或日内)精密度及批间(或日间)精密度。

    批内精密度(within-run precision)：是同一次测定的精密度。通常采用高、中、低三种浓度的同一样品各7-10份，每种浓度的样品按所拟定的分析方法操作，一次开机后，一一测定。计算每种浓度样品的SD值及RSD值。批内精密度也可视为日内精密度(with- in-day precision)。所得RSD应争取达到5%以内，但不能超过10%。

    批间精密度(between-run precision)：是不同次测定的精密度。通常采用高、中、低三种浓度的同一样品，每种浓度配制7-10份，置冰箱冷冻。自配制样品之日开始，按所拟定的分析方法操作，每天取出一份测定，计算每种浓度样品的SD值及RSD值。批间精密度也可视为日间精密度(day to day precision)。所得RSD应控制在15%以内。

    b 、准确度(accuracy)

    是指测得结果与真实值接近的程度，表示分析方法测量的正确性。

    由于“真实值”无法准确知道，因此，通常采用回收率试验来表示。生物药物分析中，常用标准添加法来计算回收率，即取已准确测定药物含量P (present)的真实样品(如人血浆样品等)，再加入药物标准品已知量A (added)，混合物作为测定液，其测定值为M (measured)。测定液要配制成高、中、低三种浓度，每个浓度测定3-5次，求出每种浓度的平均测定值M，且RSD应符合要求。由于预先要准确测定样品中原含有的药物量P，因此也应测定3-5次，求其平均值P，且RSD应符合要求。

    回收率＝ (测定液平均测定值M - 原样品液含量平均值P)/ 加入量A×100%

    回收率结果越接近100%表明分析方法准确度越高。生物样品分析时，一般控制回收率范围应为85%-115%(样品药浓>200ug/L)及80%-120%(样品药浓<200ug/L)。

    制剂的含量测定时，采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法作回收试验及计算RSD，还应作单独辅料的空白测定。每份均应自配制模拟制剂开始，要求至少测定高、中、低三个浓度，每个浓度测定三次，共提供9个数据进行评价。

    回收率＝(平均测定值M -空白值B)/ 加入量A×100%

    回收率的RSD一般应为2%以内。

    c.检测限(limit of detection，LOD)

    是指分析方法能够从背景信号中区分出药物时，所需样品中药物的最低浓度，无需定量测定。

    LOD是一种限度检验效能指标，它既反映方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后空白(本底)值的高低。要根据采用的方法来确定检测限。当用仪器分析方法时，可用已知浓度的样品与空白试验对照，记录测得的被测药物信号强度S与噪音(或背景信号)强度N，以能达到S/N＝2或S/N＝3时的样品最低药浓为LOD；也可通过多次空白试验，求得其背景响应的标准差，将三倍空白标准差(即3δ空或3S空)作为检测限的估计值。为使计算得到的LOD值与实际测得的LOD值一致，可应用校正系数(f)来校正，然后依之制备相应检测限浓度的样品，反复测试来确定LOD。如用非仪器分析方法时，即通过已知浓度的样品分析来确定可检出的最低水平作为检测限。

d.定量限 (limit of quantitation，LOQ)

    是指在保证具有一定可靠性(一定准确度和精密度)的前提下，分析方法能够测定出的样品中药物的最低浓度。

    它反映了分析方法测定低药物浓度样品时具有的可靠性。它与上述的检测限的差别在于：定量限要定量测定某一药物在样品介质中的最低浓度，且定量限规定的最低浓度应该符合一定的精密度和准确度的要求。确定定量限的方法也因所用方法不同而异。当用非仪器分析方法时，与上述检测限的确定方法相同；如用仪器分析方法时，则往往将多次空白试验测得的背景响应的标准差(即空白标准差)乘以10，作为定量限的估计值，继之，再通过分析适当数量已知接近定量限或以定量限制备的样品来验证。

    e.选择性(selectivity)

    是指在样品介质中有其他组分共存时该分析方法对供试物质准确而专属的测定能力。

    它与专属性(specificity)的含义稍有不同。专属性是指一种方法仅对一种分析成分产生唯一信号；选择性则可对多种化学成分产生不同响应，而主要成分的响应可与其它响应区分。

    因此，选择性是指该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的量度。

    在药物分析中考察一个分析方法的选择性时，应着重考虑杂质、降解产物、相关化合物以及制剂辅料等其他组分是否对被测药物的测定有干扰。一般，通过添加上述物质的样品与未曾添加的样品所得分析结果进行比较而确定。

    f.线性与范围 (linearity and range)

    分析方法的线性是在给定范围内获取与样品中供试物浓度成正比的试验结果的能力。换句话说，就是供试物浓度的变化与试验结果(或测得的响应信号)成线性关系。

    所谓线性范围是指利用一种方法取得精密度、准确度均符合要求的试验结果，而且成线性的供试物浓度的变化范围，其最大量与最小量之间的间隔，可用mg/L ~ mg/L、 ug/ml ~ ug/ml等表示。

    线性与范围的确定可用作图法(响应值Y/浓度X)或计算回归方程(Y＝a+bX)来研究建立。

    测定样品时所有生物药物分析方法都必须同时作标准曲线。每次作标准曲线时，方法应与分析方法考核时完全一致。标准浓度应包括一定梯度的5-8个浓度(非线性者如免疫分析可适当增加)，每个浓度只需测定一次(免疫分析可测定两次并取均值)；标准曲线应覆盖样品可能的浓度范围，对于含量测定要求一般浓度上限为样品最高浓度的120%，下限为样品最低浓度的80% (但应高于LOQ)；目前仍广泛采用相关系数(r)表示标准曲线的线性度、并控制r≥0.9900。对照品的LOQ必须包括在线性范围。

    g. 耐用性 (robustness)

    是指利用相同的方法在各种正常实验条件下对同一样品进行分析所得结果的重现程度。

    所谓各种正常实验条件，包括不同的实验室、不同的分析人员、不同的仪器、不同批号的试剂、不同的测试耗用时间、不同的分析温度、不同的测定日期等等。分析方法重现性的测定是通过在不同实验室由不同的实验者(操作和环境条件虽有差别但仍在规定的分析参数内)对同一样品的分别测试而获得的。

    h、重现性 (ruggedness)

    即是指在不同实验室中使用此种分析方法的精密度。

    是评价其保持不受参数微小变差影响的能力，并可作为正常使用的一个可靠性指标。

    i. 与参比方法测得结果的相关程度的比较

    由于生物样品中含有许多干扰测定的杂质，特别是与原型药物相似的代谢物常对药物的测定有影响。因此，除考察选择性外，有时还用参比方法对实际生物样品同时测定并进行比较。比较试验时，取若干份实际样品

    (如病人服药后采取的血样)，用一个已证明有相当专属性和可靠性的方法与新建立的方法同时进行测定，以参比方法测得的药浓为横坐标(X)，以新建立方法测得的药浓为纵坐标(Y)作成散布图(scatter diagram)，并求出直线回归方程 (y＝a+bx)及相关系数 (r)。r最大值为1，表示两法完全相关(结果完全吻合)；r＝0时，表示两法完全不相关。一般要求两法的相关系数r>0.95，而相关直线的斜率 (b) 应接近于1。

    评价一种分析方法的效能，并不一定对上述各项指标都有要求。一般.根据方法的使用对象有所区别。大体上有以下四种情况：

    A.用于原料药中主要组分或制剂中有效组分含量测定的方法：除了检测限和定量限二项指标外，对精密度、准确度、选择性、线性与范围、耐用性等均应有所要求；

    B.用于原料药中杂质测定或制剂中降解产物测定的方法又可分为两种：①用于含量测定；②用于限度检查。

    对于①法的要求是：除检测限和精密度指标不必要求外，对准确度、选择性、线性与范围、定量限、耐用性等均应有所要求；

    对于②法的要求是：只对检测限、选择性和耐用性三项指标有所要求，其余均无需要 求。

    C.用于溶出度测定的方法及药物释放度测定的方法，只有精密度和耐用性有所要求，其余项目均不作要求。

    D.用于生物样品中药物测定的方法，对精密度、准确度、检测限、选择性、可测线性范围、定量限、对生物样品的耐用性以及与参比方法测得结果的相关程度的比较等指标应有所要求。

謝謝你的精心整理
我接收了

非常感谢传授

谢谢楼主了

楼主真强大