1藤三七多糖对·OH清除率的测定（H₂O₂/Fe²⁺体系法）

1.1 H₂O₂/Fe²⁺反应体系原理

Fenton反应是最常见的产生羟自由基的化学反应,在H₂O₂/Fe²⁺体系法中通过Fenton反应，H₂O₂产生·OH，邻二氮菲-Fe²⁺被·OH氧化为邻二氮菲-Fe³⁺，其536 nm处吸收峰消失，因此测定此处吸收值的变化可间接得知·OH的变化情况。

1.2 溶液的配制

多糖样品溶液的配制

取藤三七多糖4 mg，置于10 mL量瓶中，用水定容至刻度，备用。

0.75 mmol·L^-1邻二氮菲溶液的配制

取200 mg邻二氮菲，加无水乙醇使溶解成20 mL，取此溶液3.75 mL，用蒸馏水稀释至250 mL，摇匀，即得。

150 mmol·L^-1 pH值7.4 PBS溶液的配制

甲液：取7.164 g Na₂HPO₄·12 H₂O，加水溶解，并稀释至100 mL。乙液：取3.12 gNaH₂PO₄·2 H₂O，加水溶解，并稀释至100 mL。取上述甲液81 mL与乙液19 mL混合，摇匀，稀释至150 mL，即得。

1.3 样品的测定

将各多糖样品配成浓度为4 mg·mL^-1的溶液。取6支试管，分别加入0.75 mmol·L^-1邻二氮菲溶液1 mL，150 mmol·mL^-1 pH 7.4 PBS 1.5 mL，充分混匀后，加入0.75 mmol·L^-1 FeSO₄溶液1 mL，每加1管立即混匀，然后向其中一管加入0.01 %H₂O₂ 1 mL（损伤），另一管不加H₂O₂（未损伤），以蒸馏水补充体积，37 ℃保温60 min后，以磷酸盐缓冲液为参比，分别测536 nm时吸收值，得A_损伤与A_未损伤。其余4管分别加入一定的各多糖溶液（每次所加的体积不同），混匀，再分别加入0.01 %H₂O₂ 1 mL，37 ℃保温60 min后以同浓度的多糖液作参比，测536 nm时的吸收值，即得A_样。重复5次，以下式计算·OH清除率：

·OH清除率（S%）= （A_样－A_损伤）/（A_未损伤-A_损伤）×100%

Tab 1 Sample and solvent adding table

试剂	损伤管(mL)	未损伤管(mL)	加样管(mL)
150 mmol·mL^-1 pH值7.4 PBS溶液	1.5	1.5	1.5
0.75 mmol·L^-1邻二氮菲溶液	1	1	1
0.75 mmol·L^-1 FeSO₄溶液	1	1	1
0.01%H₂O₂溶液	1	-	1

在本实验条件下，藤三七多糖对·OH清除率的结果见图1。

Fig 1 Scavenging capacities of polysaccharide on ·OH(%)

从图1可以看出，藤三七多糖对H₂O₂/Fe²⁺体系产生的·OH具有清除作用，且随着藤三七多糖加入量的增加，清除率上升，即清除率与多糖的用量存在一定的量效关系，最大清除率可达到43.83%。

2 藤三七多糖对O₂^-·清除率的测定（邻苯三酚自氧化法）

2.1 邻苯三酚自氧化法反应体系原理

在碱性条件下,邻苯三酚发生自氧化反应,生成O₂^-·和有色中间产物,该有色物质在 325 nm处有一特征吸收峰。当加入清除剂时,O₂^-·的生成受到抑制,邻苯三酚的自氧化反应受阻,溶液在 325 nm处的吸光度减小。故通过测定A₃₂₅值可以定量计算出清除剂的清除率。

2.2 邻苯三酚自氧化速率测定

取4.5 mL pH8.2 50 mmol·L^-1Tris-HCl缓冲液，1.2 mL蒸馏水，混匀后加入25℃预热过的邻苯三酚0.3 mL（以10 mmol·L^-1 HCl配制，空白管用10 mmol·L^-1 HCl代替邻苯三酚的HCl溶液），迅速摇匀后倒入比色杯，325 nm下每隔30 s测定吸光度，计算线性范围内每分钟吸光度的增加ΔA₀。

Tab 2 Sample and solvent adding table

试剂	空白管(mL)	自氧化管(mL)
pH8.2、50mmol·L^-1 Tris-HCl	4.5	4.5
10 mmol·L^-1 盐酸	0.3	-
50 mmol·L^-1邻苯三酚	-	0.3
H₂O	1.2	1.2

2.3 样品的测定

取藤三七多糖4 mg，精密称定，以蒸馏水溶解定容至10 mL量瓶中，在加入邻苯三酚前，先加入一定体积的多糖溶液，蒸馏水减少，然后按下述方法计算清除率。

清除率（%）=（△Ao―△A）/（△Ao）×100%

其中：△Ao为邻苯三酚自氧化速率，△A为加入多糖溶液后邻苯三酚的自氧化速率，单位均为吸光度每分钟的增加值。

Tab 3 Sample and solvent adding table

试剂	样品空白管(mL)	样品管(mL)
pH8.2、50mmol·L^-1 Tris-HCl	4.5	4.5
10 mmol·L^-1 盐酸	0.3	-
H₂O	0.7	0.7
50 mmol·L^-1邻苯三酚	-	0.3

在本实验条件下，藤三七多糖对O₂^-·的清除率结果见图2。

Fig 2 Scavenging capacities of polysaccharide on O₂^-·(%)

由图2可以看出，藤三七多糖对邻苯三酚自氧化过程中产生的O₂^-·具有一定的抑制作用，并且随藤三七多糖用量的增加其消除率逐渐上升，具有一定的量效关系，最大清除率可达到35.42 %。

5.3 小结

试验证明藤三七多糖在一定的浓度范围内，对羟自由基有较好的清除作用，并且随着多糖浓度的增加，对羟自由基的清除作用增强，且呈明显的量效关系；对超氧阴离子自由基也有清除作用，且亦呈明显的量效关系。

邻苯三酚自氧化试验检测波长的选择邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，在自氧化过程中产生超氧阴离子，超氧阴离子又加速邻苯三酚的自氧化速率，同时产生有色中间产物，根据邻苯三酚自氧化速率测定方法，采用紫外分光光度计在190 nm~700 nm范围内进行全波长扫描，结果表明325 nm处有强烈吸收，变化显著，并且样品无干扰，因此检测波长测定为325 nm。