主题：【热点】蛋白质组学研究

蛋白质组学常用的技术方法     

    蛋白质组学是技术发展的产物，它的发展受到技术发展驱动的同时也受到技术发展的制约。蛋白组学的研究技术具有三个鲜明的特点：没有任何一种单一的技术平台能够满足蛋白质组学研究的全部需要；越接近蛋白质功能测定，研究技术越不成熟；虽然迄今为止尚没有成熟的真正的蛋白质组学研究技术，但是以质谱(MS)为基础的双向电泳(2一DE)和双向高压液相色谱技术(2DHPLC)是目前较成熟的研究表达蛋白质组学的技术平台，大规模酵母双杂交是较常用的研究蛋白质相互作用的技术方法。

    1．2一DE—MS

    2一DE是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，是目前蛋白质组学研究分析最常采用的方法：

    第一步，运用2一DE技术分离样品中的蛋白质。在2一DE中，蛋白质首先根据等电点的不同在第一向等电聚焦电泳(IEF)中分离，平衡后转移到第二向SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)中根据蛋白质的相对分子量大小不同被分离，使复杂蛋白质混合物中的蛋白质依据各自的等电点和分子量在二维平面上分开，然后采用计算机作基础的图像采集、数据处理，对电泳图谱进行斑点检测、背景消减和数据构建等分析。

    第二步，切下蛋白斑点，酶切后应用质谱技术鉴定蛋白质。质谱技术是将样品分子离子化后根据离子间的质核比和基质的差异来分析并确定分子量的方法。

    第三步，应用生物信息学技术存储、处理和比较获得的数据。在目前情况下，双向凝胶电泳的可分离出3000—4000个，甚至10000个可检测的蛋白斑点。

    近年来，对2一DE技术做了很多改进使其对难溶性和碱性蛋白的显示及2一DE的重现性和分辨率有了较大幅度的提高。如SB3—10等新型去污剂的运用使难溶蛋白有了更好的显示；采用固定化pH梯度胶，极大提高了2一DE对极酸极碱性蛋白的显示并且大幅提高了2一DE重现性；采用对样品进行预分离、宽范围PH胶条、多根窄范围PH胶条等策略极大的提高了2一DE的分辨率，尤其值得一提的是自由流电泳可以把样品依照等电点分成96个组分之多，可以极大地提高2一DE的分辨率。

    传统的2一DE及染色方法进行表达蛋白质组的比较研究经常被凝胶，样品和染色时操作的差异所困扰。近年来出现的荧光差异双向凝胶电泳(DIGE)用一块胶来分离不同荧光染料标记的两个或多个蛋白样品，显著地减少了这些困扰，提高了重复性。最近DIGE技术的革新，特别是内标的引入，进一步提高了这一技术的定量的准确性和统计的可靠性。

2．2DHPLC—MS

    2DHPLC—MS是目前较成熟的研究表达蛋白质组学的技术平台。第一步2DHPLC技术分离多肽。将提取的蛋白样品酶解成肽段。2DHPLC分离，第一相根据分子大小分离多肽，第二相采用反向层析技术分离多肽。第二步，质谱鉴定肽段并解析成蛋白质。第三步，应用生物信息学技术存储、处理和比较获得的数据。这种技术在蛋白提取后或在细胞培养早期可以同位素标记以达到定量的目的。可以给蛋白肽段进行同位素或其它标记以利于定量。

3．大规模酵母双杂交法

    酵母双杂交是研究蛋白质相互作用的常用方法。传统的酵母双杂交法可分为矩阵筛选法，和文库筛选法。矩阵筛选法是将表达不同“猎物”蛋白的酵母单克隆分别与带有不同“诱饵”蛋白的酵母株接合形成二倍体细胞，通过报道基因的表达来鉴定它们的相互作用。文库筛选法是将表达“猎物”蛋白的酵母细胞构成的文库分别与表达不同“诱饵”蛋白质的酵母细胞接合，再筛选它们发生相互作用所形成的阳性克隆。    随着，蛋白质组技术蓬勃兴起，迅速渗透到生命医药的各个研究领域，中药研究者们借助这一研究方法开始对中医证候的物质基础和中药及其单体的作用机理进行了探讨。

搞不动。。。。晕啊

thank you

看了有点晕，以后再仔细看一遍

不错，多发这样的帖子，我现在向核酸蛋白纯化和双向电泳技术方向走，需要多学习！

结构和功能，生命科学最本质的问题；蛋白组学也势必要和更新鲜的概念学科：化学生物学进行融合。

我们实验室用的就是酵母,用酵母表达人源的一些蛋白.但是酵母实在太难养,动不动就死...养的周期还很长