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紫外可见分光光度法
• 光学分析法
光学分析法—利用辐射与物质间相互作用进行定性、定量的分析方法。
          光谱法  光学光谱：原子吸收、紫外可见、荧光分析、原子发射等
光  学            其它光谱：核磁共振、顺磁共振、X射线荧光等
分析法
          非光谱法：折射法、偏振法、旋光法、园二向色散法、X 射线衍射法等

• 电 磁 波
一. 电磁波
    电磁波：实验证实，电磁波（电磁辐射）是一种以极高速度传播的光量子流。既具有粒子性，也具有波动性。
1. 波动性：其特征是每个光子具有一定的波长，可以用波的参数如  波长（ë）、频率（í） 、周期（T） 、及振幅（A）等来描述。
    由于在真空中，所有电磁波均以同样的最大速度 “C ” 传播，各种辐射在真空中有固定的波长：
                                            (1)
    但电磁波在任何介质中的传播速度都比在真空中小，通常用真空中的 “” 值来标记各种不同的电磁波。
波长单位：    紫外可见区  常用  “nm”
                    红 外光 区  常用  “㎛”
                    微  波  区  常用  “cm”
2. 粒子性  电磁辐射与物质之间能量的转移用粒子性来解释
    特征：辐射能是由一颗一颗不连续的粒子流传播的，这种粒子叫光量子，是量子化的（发射或被吸收）。
    光量子的能量：  E = h      式中：h — plank 常数，其值为 6.62610-34 J•S
光量子能量与波长的关系为：              （2）
例如：  为200nm的光，一个光量子的能量是：

  由于光量子能量小（10-19J），因此定义： 1eV（电子伏）= 1.602110-19 J
  则  上例中     
   
  由（2）式        可知：  E，     E
      即：  随着 ，辐射波动性变得较明显；
            随着 ，辐射的粒子性表现的较明显。
二. 电磁波
      电磁波谱：电磁辐射按波长顺序排列称为电磁波谱。
紫外可见分光光度法：是根据物质分子对紫外及可见光谱区光辐射的吸收特征和吸收程度进行定性、定量的分析方法。

• 分子吸收光谱
一. 分子吸收光谱的产生
（一）分子能级与电磁波谱
    分子中包含有  原子和电子，分子、原子、电子都是运动着的物质，都具有能量，且 都是量子化的。在一定的条件下，分子处于一定的运动状态，物质分子内部运动状态有三种形式：
①电子运动：电子绕原子核作相对运动；
②原子运动：分子中原子或原子团在其平衡位置上作相对振动；
③分子转动：整个分子绕其重心作旋转运动。
  所以：分子的能量总和为
              E分子 = Ee +Ev +Ej +⋯ (E0 +E平)                (3)
    分子中各种不同运动状态都具有一定的能级。三种能级：电子能级 E（基态 E1 与激发态 E2）
                    振动能级 V= 0，1，2，3 ⋯
                    转动能级 J = 0，1，2，3 ⋯
    当分子吸收一个具有一定能量的光量子时，就有较低的能级基态能级 E1 跃迁到较高的能级及激发态能级 E2 ，被吸收光子的能量必须与分子跃迁前后的能量差∆E 恰好相等，否则不能被吸收。


图1  双原子分子的三种能级跃迁示意图



对多数分子          对应光子波长            光      谱

    ∆E 约为1~20eV            1.25 ~ 0.06㎛          紫外、可见区(电子)
    ∆E 约为0.5~1eV            25 ~ 1.25㎛            (中)红外区 (振动)
∆E约为10-4~0.05eV        1.25cm~ 25㎛          （远）红外区(转动)

      分子的能级跃迁是分子总能量的改变。当发生电子能级跃迁时，则同时伴随有振动能级和转动能级的改变，即 “电子光谱”——均改变。
    因此，分子的“电子光谱” 是由许多线光谱聚集在一起的带光谱组成的谱带，称为“带状光谱”。
    由于各种物质分子结构不同  对不同能量的光子有选择性吸收   吸收光子后产生的吸收光谱不同   利用物质的光谱进行物质分析的依据。

二. 紫外-可见吸收光谱与有机分子结构的关系
（一）电子跃迁的类型
    许多有机化合物能吸收紫外-可见光辐射。有机化合物的紫外-可见吸收光谱主要是由分子中价电子的跃迁而产生的。
    分子中的价电子有：
          成 键 电 子：  电子、 电子（轨道上能量低）
          未成键电子： n 电子（  轨道上能量较低）
    这三类电子都可能吸收一定的能量跃迁到能级较高的反键轨道上去，见 图-3：

图2  分子中价电子跃迁示意图

1.  - * 跃迁
  -*的能量差大所需能量高吸收峰在远紫外 (<150nm)
    饱和烃只有 、* 轨道，只能产生 - *跃迁，例如：
    甲烷 吸收峰在 125nm；乙烷 吸收峰在 135nm ( < 150nm )
  ( 因空气中O2对< 150nm辐射有吸收，定量分析时要求实验室有真空条件，要求一般难达到）
2. -* 跃迁
  -*能量差较小所需能量较低吸收峰紫外区 (200nm左右)
  不饱和烃类分子中有电子，也有* 轨道，能产生-*跃迁：CH2=CH2 ,吸收峰  165nm。（吸收系数  大，吸收强度大，属于强吸收）
3. n- *跃迁
    n- * 能量较低  收峰紫外区  ( 200nm左右)  （与-*接近）
    含有杂原子团如：-OH，-NH2 ，-X，-S 等的有机物分子中除能产生
-* 跃迁外，同时能产生n-  *跃迁，例如：三甲基胺 (CH3)3N- 的 n- * 吸收峰在 227 nm，  约为900 L/mol•cm ，属于中强吸收。
4. n- *跃迁
  n- *能量低  吸收峰 在 近紫外、可见区  ( 200 ~ 700nm)含有杂原子的不饱和基团，如  -C=O，-CN 等，例如：    丙酮： n- *跃迁， max 280nm左右（同时也可产生-*跃迁），属于弱吸收，  < 500 L/mol•cm .
    各种跃迁所需能量大小次序为：  - * > n- *  -* > n- *
    紫外-可见吸收光谱法在有机化合物中应用主要以：-* 、n- * 为基础。
（二）吸收峰的长移和短移
          长移：吸收峰向长λ 移动的现象，又称 红移；
          短移：吸收峰向短λ移动的现象，又称 紫移；
          增强效应：吸收强度增强的现象；
          减弱效应：吸收强度减弱的现象。
（三）发色团和助色团
    -* 、n- *跃迁都需要有不饱和的官能团以提供  轨道，因此，轨道的存在是有机化合物在紫外-可见区产生吸收的前提条件。
1.发色团：具有  轨道的不饱和官能团称为发色团。
  主要有： -C=O，-N=N-， -N=O， -CC- 等。
但是，只有简单双键的化合物生色作用很有限，其有时可能仍在远紫外区，若分子中具有单双键交替的 “共轭大键” （离域键）时，
如：  丁二稀          CH2=CH—CH=CH2
    由于大键中的电子在整个分子平面上运动，活动性增加，使 与 * 间的能量差减小，使 - * 吸收峰长移，生色作用大大增强。
2. 助色团
    本身不“生色”，但能使生色团生色效应增强的官能团 ——称为助色团
    主要有： – OH、  –NH2、  –SH、 –Cl、 –Br 等
（具有未成键电子轨道 n 的饱和官能团）
    当这些基团单独存在时一般不吸收紫外-可见区的光辐射。但当它们与具有轨道的生色基团相结合时，将使生色团的吸收波长长移（红移），  且  使吸收强度增强。
（助色团至少要有一对与生色团  电子作用的孤对电子）
（四）溶剂效应（溶剂的极性对吸收带的影响）
          -* 跃迁：溶剂的极性   长移
三. 吸收光谱
    吸收光谱： 又 称吸收曲线，是以波长（）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标所描绘的图形。
特征： 吸收峰  曲线上比左右相邻处都高的一处；
              max    吸收程度最大所对应的 （曲线最大峰处的 ）
              谷      曲线上比左右相邻处都低的一处；
              min      最低谷所对应的 ；
              肩峰    介于峰与谷之间，形状像肩的弱吸收峰；
            末峰吸收  在吸收光谱短波长端所呈现的强吸收而不呈峰形的部分。

图3  吸收曲线示意图

定性分析：吸收光谱的特征（形状和 max ）
定量分析：一般选 max 测吸收程度（吸光度 A）
• 光的吸收定律
一. Lambert-Beer 定律——光吸收基本定律
      “ Lambert-Beer 定律 ” 是说明物质对单色光吸收的强弱与吸光物质的浓度（c）和 液层厚度 （b）间的关系的定律，是光吸收的基本定律，是紫外-可见光度法定量的基础。
Lambert定律 —— 吸收与液层厚度 （b）间的关系
  Beer 定律 —— 吸收与物质的浓度（c）间的关系
    “ Lambert-Beer 定律 ”可简述如下：
    当一束平行的单色光通过含有均匀的吸光物质的吸收池（或气体、固体）时，光的一部分被溶液吸收，一部分透过溶液，一部分被吸收池表面反射；
设：入射光强度为 I0，吸收光强度为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir，则它们之间的关系应为：
                I0 = Ia + It + Ir                                (4)
    若 吸收池的质量和厚度都相同，则 Ir 基本不变，在具体测定操作时 Ir 的影响可互相抵消（与吸光物质的 c及 b 无关）
上式可简化为：          I0 = Ia + It                                    (5)
                      (6)
实验证明：当一束强度为 I0 的单色光通过浓度为 c、液层厚度为 b 的溶液时，一部分光被溶液中的吸光物质吸收后透过光的强度为  It ，则  它们之间的关系为：

                称为透光率，用 T % 表示。
                称为 吸光度，用 A 表示
      则                A = -lgT = K • b •c                      (7)
      此即    Lambert-Beer  定律  数学表达式。
    L-B 定律 可表述为：当一束平行的单色光通过溶液时，溶液的吸光度 (A) 与溶液的浓度 (C) 和厚度 (b) 的乘积成正比。它是分光光度法定量分析的依据。

二. 吸光度的加和性
设 某一波长（  ）的辐射通过几个相同厚度的不同溶液c1，c2⋯⋯ cn，其透射光强度分别为 I1， I2 ⋯⋯ In，根据吸光度定义：这一吸光体系的总吸光度为 

而 各溶液的吸光度分别为：
    (8)

吸光度的和为：                      (9)
即  几个（同厚度）溶液的吸光度等于各分层吸光度之和。
    如果溶液中同时含有 n 中吸光物质，只要各组分之间无相互作用（不因共存而改变本身的吸光特性），则：
A = K1C1 b1 + K2C2 b2 + ⋯⋯ KnCn bn = A1 + A2+ ⋯⋯ + An    (10)
应用：①进行光度分析时，试剂或溶剂有吸收，则可由所测的总吸光度 A 中扣除，即 以试剂或溶剂为空白的依据；
      ②测定多组分混合物；
      ③校正干扰。
三. 吸光系数
    Lambert-Beer  定律中的比例系数“K ”的物理意义是：吸光物质在单位浓度、单位厚度时的吸光度。
    一定条件（T、  及溶剂）下， K 是物质的特征常数，是定性的依据。
    K 在标准曲线上为斜率，是定量的依据。常有两种表示方法：
1. 摩尔吸光系数（）：当 c用 mol/L 、b 用 cm 为单位时，用摩尔吸光系数   表示，单位为 L/mol•cm
                    A =  • b • c                        (11)
     与 b及 c 无关。   一般不超过 105 数量级，通常：   > 104 为强吸收；             < 102 为弱吸收； 102 >   > 104 为中强吸收。
    吸收系数不可能直接用 1 mol/L 浓度的吸光物质测量，一般是由较稀溶液的吸光系数换算得到。
2. 吸光系数
    当 c 用 g /L ，b 用 cm 为单位时，K 用吸光系数 a 表示，单位为 L/g•cm
                    A = a • b • c                      (12)
       与 a 之间的关系为：     = M • a                      (13)
       ——通常多用于研究分子结构
      a ——多用于测定含量。
四. 引起偏离 Lambert-Beer  定律的因素
    根据 L-B  定律，A与c的关系应是一条通过原点的直线，称为“标准曲线”。但事实上往往容易发生偏离直线的现象而引起误差，尤其是在高浓度时。导致偏离L-B定律的因素主要有：
1. 吸收定律本身的局限性
    事实上， L-B  定律是一个有限的定律，只有在稀溶液中才能成立。由于在高浓度时（通常 C > 0.01mol/L），吸收质点之间的平均距离缩小到一定程度，邻近质点彼此的电荷分布都会相互受到影响，此影响能改变它们对特定辐射的吸收能力，相互影响程度取决于C，因此，此现象可导致 A与 C 线性关系发生偏差。
      此外，                      （ n 为折射率）
    只有当 c  0.01mol/L（低浓度）时，n 基本不变，才能用 代替真 。
2. 化学因素
    溶液中的溶质可因 c 的改变而有离解、缔合、配位以及与溶剂间的作用等原因而发生偏离 L-B 定律的现象。
例：在水溶液中，Cr(Ⅵ)的两种离子存在如下平衡
Cr2O42- + H2O ⇌ 2CrO42- + 2H+
Cr2O42- 、CrO42-  有不同的 A 值，溶液的 A  值是二种离子的 A 之和。但由于随着浓度的改变（稀释）或改变溶液的 pH 值， [Cr2O42- ] /[CrO42-] 会发生变化，使C总与 A总 的关系偏离直线。
消除方法：控制条件。
3. 仪器因素（非单色光的影响）
    L-B 定律的重要前提是“单色光”，即 只有一种波长的光；实际上，真正的单色光却难以得到。由于吸光物质对不同  的光的吸收能力不同（  不同），就导致对的偏离。“单色光”仅是一种理想情况，即使用棱镜或光栅等所得到的“单色光”实际上是有一定波长范围的光谱带，“单色光”的纯度与狭逢宽度有关，狭缝越窄，他所包含的波长范围也越窄。
4. 其它光学因素
（1）散射和反射：浑浊溶液由于散射光和反射光而偏离 L-B
（2）非平行光
• 分光光度计
    紫外-可见分光光度计 是 在紫外可见区可任意选择不同  的光测定吸光度的仪器。
一. 紫外-可见分光光度计的主要部件
1. 光源：提供入射光的装置；
（1）钨灯或碘钨灯：发射光  范围宽，但紫外区很弱， 通常取此  > 350nm
光为可见区光源
（2）氢灯或氘灯：气体放电发光光源，发射150~400nm的连续光谱，用作紫外区                同时配有： 稳压电源（稳定 I0 ）；光强补偿装置； 聚光镜等。
2. 单色器：将来自光源的光按波长的长短顺序分散为单色光并能随意调节所需波长光的一种装置。
（1）色散元件——把混合光分散为单色光的元件是单色器的关键部分！）
常用的元件有：
    棱镜——由玻璃或石英制成，它对不同 的光有不同的折射率，将复合光分开
但：光谱疏密不均  长   区密，短   区疏
光栅——由抛光表面密刻许多平行条痕（槽）而制成，利用光的衍射作用和干扰作用使不同  的光有不同的方向，起到色散作用。（光栅色散后的光谱是均匀分布的）
（2）狭缝——入口狭缝：限制杂散光进入  出口狭缝：使色散后所需  的光通过
（3）准直镜——以狭缝为焦点的聚光镜其作用为：将来自于入口狭缝的发散光变成单色光把来自于色散元件的平行光  聚集于出口狭缝
3. 吸收池：装被测溶液用的无色、透明、耐腐蚀的池皿光学玻璃吸收池——只能用于可见区  石英吸收池——可用于紫外及可见区。
    定量分析时：吸收池应配套（同种溶液测定 ∆A < 0.5%）
4. 检测器：将接受到的光信号转变成电信号的元件。
常用的有：
（1）光电管  一真空管内装有：
一个丝状阳极——用镍制成
              一个半圆筒状阴极——金属制成，凹面涂光敏物质。
国产光电管：紫敏光电管：用锑、铯做阴极，适用范围200~625nm
            红敏光电管：用银、氧化铯作阴极，适用范围625~1000nm
（2）光电倍增管：原理与光电管相似，结构上有差异。
5. 显示器：电表指针、数字显示、荧光屏显示等
          显示方式：A、T(%)、c 等
二. 分光光度计的类型
    常见的可见及紫外-可见分光光度计：
1. 单波长、单光束分光光度计（721、722、752 型等）
    一个单色器；一种波长的单色光；一束单色光。
2. 单波长双光束分光光度计
从一个单色器获取一个波长的单色光用切光器分成二束强度相等的单色光实际测量到的吸光度 A 应为 ∆A ( As- AR)
                        (14)
式中消去了I0 , 即消除了光源不稳定性引起的 A 值测量误差。
3. 双波长分光光度计
  二个单色器得到二个波长不同的单色光。
    两束波长不同的单色光（1、2 ）交替地通过同一试样溶液（同一吸收池）后照射到同一光电倍增管上，最后得到的是溶液对 1和 2两束光的吸光度差值 ∆A 即A1 -A2 ：
       





图4  双波长双光束分光光度计以双波长单光束方式工作时的光学系统图

若用于测定浑浊样品或背景吸收较大的样品时，可提高测定的选择性，用 AS 表示非待测组分的吸光度(背景吸收)则
            (15)
            (16)
    一般情况下：由于1 与 2 相差很小，可视为相等（As 一般不受的影响，或影响甚微）
    ∴          As（1） =  As（2）
          因此，通过吸收池后的光强度差为
                (17)
该式表明：试样溶液中被测组分的浓度与两个波长1 和 2处的吸光度差 ∆A 成比例，这是双波长法的定量依据。 双波长分光光度计不仅可测定多组分混合试样、浑浊试样，而且还可测得导数光谱。

• 定性及定量分析方法
一. 定性分析
    选择合适的溶剂（非极性），使用有足够纯度单色光的分光光度计，在相同的条件下测定相近浓度的待测试样和标准品的溶液的吸收光谱，然后比较二者吸收光谱特征：吸收峰数目及位置、吸收谷及肩峰所在的位置（  ）等；分子结构相同的化合物应有完全相同的吸收光谱。
二. 定量分析
（一）单组分定量分析方法
1. 标准曲线法：配制一系列（5~10）个不同c的标准溶液 ，在适当 —— 通常为 max下，以适当的空白溶液作参比，分别测定A，然后作 A-c 曲线同条件下测定试样溶液吸光度 Ax ，查找对应的 cx 。
2. 直接比较法：已知试样溶液基本组成，配制相同基体、相近浓度的标准溶液，分别测定吸光度A标、A样
  根据 L-A 定律： A标 = K • b • c标            A样 = K • b • c样
  则                                              (18)
（二）多组分定量分析
    混合组分的吸收光谱相互重叠的情况不同，测定方法也不相同，常见混合组分吸收光谱相干扰情况有以下三种：





图5  混合组分吸收光谱的三种相干情况示意图
1.第一种情况：各种吸光物质吸收曲线不相互重叠或很少重叠，则可分别在1 及 2 处测定 a  及 b 组分的 c；
2. 第二种情况  部分重叠：先在 1 处测得 ca  ,再在 2 处测得混合组分的吸光度 Aa+b ，根据吸收定律加和性：


即可求得cb。[应先求得 a(2 ) ，与 a(2 ) ，并使用相同 b ]
3. 第三种情况:两吸收曲线互相重叠，但服从 L-B 定律
(1) 解方程组法：
    若试样中需要测定两种组分，则选定两个波长1 及 2 ，测得试液的吸光度为 A1和 A2，则可解方程组求得组分a、b 的浓度ca、cb ：
    （在 1 处）
    （在 2 处）    (19)
    如果混合物含有 n 个组分，可不经分离，在 n 个适当波长处进行 n 次测量，获得 n个吸光度值，然后解 n 个联立方程以求得各组分的浓度。
（2）等吸光度双波长（消去）法
吸收光谱重叠的 d、e 两组分共存，现设法把一种组分(a)的吸光度消去。方法如下：


图6  二组分混合物吸收光谱用作图法选择1、2（双波长分光光度法）

  选取两个适当的波长1 和 2 ，

使 1d= 2d ，而 尽可能大，则用这两个波长1 和 2测得混合物溶液吸光度之差 ∆A 应只与 ce 成正比（而与cd无关），直接测得ce ：
  因为              所以     
  若用 1cm 吸收池

    若需测定另一组分 d 时，也可用同样方法，选择另一个1’ 和 2’ ，先消去的 e 的干扰，直接求cd

• 光度法显色反应条件和测量条件的选择
一. 影响显色反应的因素及反应条件的选择
（一）显色反应的选择
1. 选择性好：干扰少或易排除；
2. 灵敏度高（S）：尤其是对低含量组分，一般选择  ：104 ~ 105  L/mol•cm
3. 有色化合物稳定、组成恒定
4. 有色化合物与显色剂的颜色差别大
（二）影响显色反应的因素及反应条件
  1. 显色剂的用量
M    +    R    ⇌    MR
待测组分    显色剂        有色化合物
    在被测组分一定及其它实验条件不变的情况下，分别测得加入不同量显色剂测得A值，作A-cR曲线，常见以下二种情况：
cR                            cR
图7 吸光度与显色剂加入量的关系                        吸光度与显色剂加入量的关系
(a)                                                  (b)
          在 a 与 b之间任选一点                            严格控制CR

因此，合适的 cR 通过实验确定。
2. 溶液的酸度
(1) 对金属离子存在状态的影响——防止水解，防止沉淀生成
(2) 对显色剂浓度的影响    H2R  ⇌  2H+ + R2-
(3) 对显色剂颜色的影响
                          pKa                          pKa
H2R  ⇌  H+  +  HR-  ⇌  2H+  +  R2-
                          6.9                  12.4
黄                橙                  红
    适宜的 pH 通过实验确定：做 A- pH 曲线（其它条件并不变），从中找出 A 较大且基本不变的某 pH 范围。
3. 显色时间：各种显色反应得速度不同，反应完全所需时间不同；有些有色化合物在一定的时间内稳定。
选择方法：作 A-t（min） 曲线，选择在 A 较大且稳定的时间内进行。
4. 显色温度：显色反应一般在室温下进行，但反应速度太慢或常温下不易进行的显色反应需要升温或降温。
选择方法：作 A-T （℃）曲线，选择在 A 较大的时间内进行。
5. 溶剂：实验确定——选择合适的溶剂（常为有机溶剂），提高反应的灵敏度及加快反应速度。
二. 分光光度法测量误差及实验条件的选择
（一）测量误差及 A 范围的选择
    任何一台分光光度计都有光度误差 ∆T%，但给定的一台分光光度计， ∆T 基本上是一常数，一般为 0.002 ~  0.01，但在不同 T 时同样的 ∆T 对应的 ∆A 则不同，所以引起的∆C/C (浓度的相对误差)就不同。
    由 L-B 定律得：                          (20)
           
  将此式微分得：         
浓度相对误差为：                (21)
  设 当 ∆T =  0.01时 ，不同 T% 时所对应的 ∆c/c 可从相关表查得：
当  T% = 36.8%  即  A = 0.434时， ∆c/c 最小；
      当  T% 在 15-65% 之间  即 A 在0.2 ~ 0.8范围内，∆c/c 较小。
实际测定时：可通过控制溶液的 c 及 b 使 A 在 0.2 ~ 0.8 范围内。
（二）测量波长选择
    一般根据吸收光谱选择 max 测定——灵敏度高、A 随波长变化小若有干扰，根据“吸收大，干扰小”原则选择 。
如：3，3’-二氨基联苯（DAB）和 Se 形成配合物 Se-DAB 的最大吸收波长在340nm波长处，DAB也有很强的吸收，在这种情况下，分析波长应选用次大吸收波长420nm，否则测量误差较大。
3. 狭缝宽度
理论上，定性分析采用最小的狭缝宽度，在定量分析中，为避免狭缝太小，出射光太弱而引起信噪比降低，可以将狭缝开大一点。通过测定 A 随狭缝宽度的变化规律，可选择出合适的狭缝宽度。狭缝宽度在某个范围内，A 值恒定，狭缝宽度增大至一定程度时 A 减小，因此：合适的狭缝宽度是  在 吸光度不减小时的最大狭缝宽度。
（三）空白溶液的选择
    空白溶液是用来调节工作零点 即 A=0，T%=100% 的溶液，以消除溶液中其它基体组分以及吸收池和溶剂对入射光的反射和吸收所带来的误差。
    根据情况不同，常用空白溶液有如下选择：
1. 溶剂空白：当溶液中只有待测组分在测定波长下有吸收，而其它组分无吸收时
— 用纯溶剂作空白；
2. 试剂空白：如果显色剂或其它试剂有吸收，而待测试样溶液无吸收
— 则用不加待测组分的其它试剂作空白；
3. 试样空白：如果试样基体有吸收，而显色剂或其它试剂无吸收
— 则用不加显色剂的试样溶液作空白；
4. 平行操作空白：用溶剂代替试样溶液，以与试样完全相同的分析步骤进行平行操作，用所得的溶液作空白。
• 紫外-可见分光光度法应用
*酸碱指示剂离解常数的测定
      分光光度法可以测定酸碱离解常数，若为一元弱酸，在溶液中的离解反应为：
HB  ⇌  H+  +  B-


    若测出 [B-] 和 [HB]，就可算出 Ka。测定时，配制出三份不同 pH 的 HB 溶液，一份为强碱性溶液，另一份为强酸性溶液，分别在 B- 和 HB 的吸收峰波长处测定吸光度，由此计算出 B- 和 HB 的摩尔吸光系数。第三份为已知 pH 值的缓冲液，其 pH 值在 pKa 附近，在测得 B- 和 HB 的总吸光度后用双组分测定的方法算出 B- 和 HB 的浓度，即可计算出弱酸的离解常数。
由                  pH = pKa               
可知，当 [B-] 和 [HB] 相等时： pKa = pH
若以 pH 为横坐标，以某波长处测得的不同 pH 时的 A 为纵坐标作图，得一条 S 形曲线，该曲线的中点所对应的 pH 即为 pK 值。

原文由 daniaozxj 发表:
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紫外可见分光光度法 http://www.instrument.com.cn/show/download/shtml/027386.shtml
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这本紫外分析方法通则或许对你用，是PDF格式，前面发了一次，版主说我声望不够不给发。见附件。

【由于该附件或图片违规，已被版主删除】不好意思，没传上来，在传一次。

很好，多谢！