脂清胶囊质量标准的研究
摘要:目的建立脂清胶囊(虎杖,山楂,当归等)的质量标准控制方法。方法采用薄层色谱法(TLC)对处方中山楂、当归进行定性鉴别;采用高效
液相色谱法(HPLC)对虎杖中大黄素进行含量测定。高效
液相色谱条件: Agilent1100,ODSC18柱,流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)。结果山楂、当归的薄层色谱图斑点清晰,具有专属性;大黄素在0.306~0.816 μg范围内线性关系良好,r=0.999 9,平均回收率为99.22%,RSD为2.4%。结论 该方法能准确可靠地进行定性、定量检测,能有效地控制脂清颗粒的质量。
脂清胶囊是由虎杖、山楂、当归3味药材制成的中药复方制剂,具有活血降浊,润肠通便之功效,用于瘀浊内盛而致的高脂血症。是我院临床应用多年,疗效确切的制剂。原标准仅有理化鉴别而无薄层鉴别和含量测定,为更有效地控制药物质量,本文建立了山楂、当归的薄层色谱鉴别;大黄素的含量测定项。
1 仪器与试药
Agilent高效
液相色谱仪;TU1901双光束紫外分光光度计;SK5200H 超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司);AY120型电子天平(日本);硅胶G(青岛海洋化工厂);山楂对照药材( 92829001)、当归对照药材(9271200110)及大黄素对照品(880200001)(中国药品生物制品检定所);甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯;脂清胶囊由湖南中医学院药剂科制剂室提供。试剂:甲醇为色谱纯试剂,水为重蒸馏水,其它试剂均为分析纯。
2 质量标准
2.1 山楂鉴别
2.1.1 山楂的TLC取本品粉末1 g,加醋酸乙酯4 ml,超声处理15 min,滤过,滤液作为供试品溶液。同法制备缺山楂的阴性样品溶液。另取山楂对照药材1 g,同法制成对照药材溶液。另取熊果酸对照品,加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验,吸取上述4种溶液各2 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯醋酸乙酯甲酸(20∶4∶0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以硫酸乙醇溶液(3→10),在80℃加热至斑点显色清晰,分别置日光及紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品及对照药材色谱相应的位置上,日光下显相同紫红色斑点;紫外光灯(365 nm)下,显相同橙黄色荧光斑点。结果见图1。
2.1.2 当归的TLC 取本品1 g,加甲醇10 ml,超声提取30 min,滤过,滤液作为供试品溶液。同供试品溶液的制备方法制备缺当归的阴性样品溶液。另取阿魏酸对照品,加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法《中国药典》2000年版Ⅰ部附录ⅥB)试验[1],吸取上述3种溶液各2 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正已烷-醋酸乙酯(4∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同的颜色荧光斑点。阴性对照溶液无干扰。结果见图2。
2.2 含量测定
2.2.1 实验条件色谱条件:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;甲醇 -0.1% 磷酸溶液(80∶20)为流动相;检测波长为254 nm;柱温:25℃。流速:1 ml・min-1。理论板数按大黄素峰计算应不低于3 000。
2.2.2 测定方法对照品溶液的制备:精密称取以五氧化二磷为干燥剂减压干燥 24 h的大黄素对照品适量,加甲醇配制成每毫升中含 51 μg 的溶液,即得。供试品溶液的制备:取本品10粒,研细,取约0.03 g各3份,精密称定,置具塞三角瓶中,精密加入氯仿 25 ml 和 2.5 mol/L 硫酸溶液 20 ml ,称定重量,置水浴中分别加热回流 1 ,2,3 h(水温 80 ℃ ),冷却至室温,再称定重量,用氯仿补足减失的重量,摇匀,精密吸取氯仿层 10 ml ,蒸干,残渣用甲醇溶解并定容至 10 ml ,用微孔滤膜( 0.45 μm )滤过,取续滤液即得。阴性溶液的制备:按处方制成的缺虎杖的样品0.03g,精密称取,照供试品溶液的制备方法制备。
2.3 测定波长的选择取大黄素对照品溶液于TU-1901双光束紫外分光光度计上进行光谱扫描,结果大黄素在254nm波长处有较大的吸收。结果见图3。
图1 山楂薄层色谱图(荧光)(略)
图2 当归薄层色谱图(荧光)(略)
图3 大黄素的紫外扫描图(略)
2.4 空白实验按上述色谱条件,吸取药材溶液、供试品溶液、对照品溶液及阴性溶液各10 μl,分别注入色谱仪中。供试品色谱图中,在与对照品色谱图相应的位置上,有一相同的色谱峰,而阴性溶液在此保留时间无干扰。结果见图4。
图4 缺虎杖的阴性样品、大黄素、虎杖、药材、供试品HPLC图谱(略)
2.5 方法学考察
2.5.1 线性关系 精密称取大黄素对照品溶液(51μg/ml),6,8,10,12,14,16 μl 注入高效
液相色谱仪,测定,以峰面积为纵坐标,进样量为(μg)为横坐标绘制标准曲线。结果表明:大黄素对照品在0.306~0.816 μg范围内线性关系良好,其回归方程为:Y=2428X-53 ,r=0.999 9。
2.5.2 精密度实验精密吸取同一供试品溶液,连续重复进样5 次,每次10 μl,测定峰面积值,结果RSD为0.52 ,精密度良好。
2.5.3 重复性实验取同一样品5份,按含量测定项下的方法分别测定,结果RSD为1.72 ,样品测定有良好的重复性。
2.5.4 稳定性实验 取同一供试品溶液,25℃室温放置,按含量测定项下的色谱条件测定其峰面积,分别于0,4,8,12,16 h进样,每次10 μl,结果RSD为1.17 ,说明样品在16 h内是稳定的,满足测试要求。
2.5.5 回收率取已知含量(64.2 mg/g)的样品约为16 mg,精密称定,共取5份,分别精密加入大黄素对照品溶液(浓度为0.51 mg/ml)2 ml,根据上述供试品溶液的制备方法制备和测定, 按外标法以峰面积计算供试品中大黄素的量,计算回收率。结果见表1。结果表明平均回收率为99.22% ,方法可靠。
表1 回收率实验(略)
2.6 样品测定取样品10批,按含量测定方法分别精密吸取对照品与供试品溶液各10 μl,注入色谱仪,按外标一点法计算样品含量。结果见表2。
表2 样品测定结果(略)
3 讨论
3.1 虎杖为方中君药,大黄素为其活血化淤、降血脂的主要成分,故本文采用HPLC法测定大黄素的含量来达到控制制剂的目的。
3.2 检测波长的选择:取大黄素对照品溶液在200~600 nm波长范围内进行扫描,结果大黄素在254 nm波长处有较大的吸收, 分别吸取药材溶液、供试品溶液、对照品溶液及阴性溶液各10 μl注入色谱仪中,供试品色谱图中,在与对照品色谱图相应的位置上,有一相同的色谱峰,而阴性溶液在此保留时间无干扰。故选定测定波长为254 nm。
3.3 在样品前处理方法考察中,我们比较了超声,回流等不同的提取方法,结果表明,采用回流提取的方法,分离效果好,重复性良好,且空白制剂无干扰,可以用于控制该制剂的质量。
3.4 方法学研究表明,采用薄层色谱法对处方中的山楂、当归进行定性鉴别斑点清晰,专属性好;采用高效
液相色谱法对虎杖中大黄素进行含量测定,结果准确,重复性好,能有效控制产品质量。
参考文献:
[1] 国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部 [S]. 北京:化学工业出版社,2005:145.