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凝胶色谱（GPC）
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主题：【求助】GPC软件测分子量

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zihuadd
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发表于：2008/06/27 23:12:48 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
请教高手：我现在在用waters 2414 示差折光检测器 美国奥泰的SEC/GPC软
件，测定羟乙基淀粉130重均分子量(Mw)

标准中规定是用5个重均分子量(Mw)与保留时间做标准曲线，标准品和样品浓度都是5mg/ml,然后测定样品分子量(Mw)

现在的测定结果普遍偏高（与原料厂家的检验报告单相比），厂家说是能校正下标准曲线是否正确：就是做完标准曲线后再回头去处理标准品图谱，计算出来的值(Mw)与标准品的分子量比较，我照他们说的做了发现会差到2万左右，且分子量越大的部分，误差越大

但是软件的工程师说是这样校正本身就是有误差的，说是用标准曲线重新计算出来的结果(Mw)是片段积分得到的，与原来的分子量会有误差

要是照工程师的说法，那这个方法本身是不合理的，个人理解还是应该用峰值分子量（Mp）与保留时间做标准曲线比较合理

好像国内一般用的都是用重均分子量(Mw)做标准曲线，连中检所培训的都是北京龙智达的GPC软件

都说是进样浓度不参与计算，与测定分子量无关，但个人认为凝胶色谱的原理是分子孔径使分子量从大到小依次流出，如果进样浓度过大，孔径填满后，小分子物质也不能被有效保留，从而与大分子物质一起流出，应该会产生检测误差，请教一般凝胶色谱的进样浓度是多少？

请问有高手也碰见过这样的情况吗？请指点下小弟，不胜感激！！！
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2008/6/28 9:03:05 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
楼主说的似乎有道理，浓度应该是有一个上限的，你可以参照下药典里边用到ＧＰＣ测分子量的一些内容．
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zihuadd
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2008/6/29 21:47:06 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
顶起来  请高手指点  大家谁做凝胶色谱 发现测定重均分子量（Mw）误差大吗？我看坛子上有说误差在10%是可以接受的 ，但是超过限度了怎么办，我的就是超过限度大约几千到一万
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nnsss
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2008/6/30 10:44:24 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
关键是你的标品与样品的浓度肯定应该接近才对
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tigertooth
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2008/6/30 12:42:33 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
国内很多用户都用的是Wyatt公司的多角度激光光散射与GPC连用测羟乙基淀粉的分子量，包括中检所。
关键问题在于你用的标样与你的样品分子的构象不同，所以测试有误差。
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2008/6/30 22:36:02 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 tigertooth 发表:
国内很多用户都用的是Wyatt公司的多角度激光光散射与GPC连用测羟乙基淀粉的分子量，包括中检所。
关键问题在于你用的标样与你的样品分子的构象不同，所以测试有误差。


请问构象不同是什么意思？

标样也是厂家提供的 是厂家自己生产的 然后再送去 用激光光散射 标定的Mw，是一样的吧 

另：我的标样和样品浓度都是 一样的  5mg/ml

谢谢了！
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tigertooth
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2008/7/1 10:53:20 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
我们一般所说的GPC又叫SEC-尺寸排阻色谱，顾名思意，靠分子尺寸分离样品，是相对方法，结果对标样和仪器的系统依赖很大。GPC测试的主要问题是样品在溶液中的构象也就是尺寸，样品在溶液中的构象大致可以用三种类型区分：棒状-刚性；无规线团和球状。相同分子量下，棒状的分子在溶液中排阻体积最大，最早出来，球状的最小最晚出来。
所以用GPC要想算的准，首先就是标样问题，你们用得是什么标样？是中检所的多糖标样如右旋糖苷，还是用激光标过的羟乙基淀粉做标样？
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2008/7/4 21:01:26 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 tigertooth 发表:
我们一般所说的GPC又叫SEC-尺寸排阻色谱，顾名思意，靠分子尺寸分离样品，是相对方法，结果对标样和仪器的系统依赖很大。GPC测试的主要问题是样品在溶液中的构象也就是尺寸，样品在溶液中的构象大致可以用三种类型区分：棒状-刚性；无规线团和球状。相同分子量下，棒状的分子在溶液中排阻体积最大，最早出来，球状的最小最晚出来。
所以用GPC要想算的准，首先就是标样问题，你们用得是什么标样？是中检所的多糖标样如右旋糖苷，还是用激光标过的羟乙基淀粉做标样？


果然是高手！！！我们用的的是激光标过的羟乙基淀粉，是Mw分子量,现在发现误差特别大,而且是测出来的值普遍偏高,中检所的多糖标样能用来测羟乙基淀粉吗?
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2008/7/7 9:40:00 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
中检所的多糖标样好像误会差更大，所以他们也不用普通GPC法。
你用激光标过的羟乙基淀粉作为参照时，你用的是哪个值，平均Mw吗？你用了几个羟乙基淀粉参照？多用几个不同分子量的试试。
另让提供数据的厂家给你峰尖（示差信号）分子量作为参考。
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viscotektegent
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2008/7/8 15:58:00 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
你的标准样品可能有问题。对于传统标定法GPC来说，在做标准曲线时，应该采用单分布的标准样品，也就是说，其重均分子量与数均分子量的比值应该是1，或者是1.0几，这样可以近似认为是1。此时，标准样品的色谱峰很窄，峰值分子量Mp近似与重均、数均相等，再用其峰值分子量做成标准曲线，然后再进样分析你的样品。如果你的样品分布较宽，那么软件算出来的分子量当然是积分出来的！此时，你可以看一下峰形是否对称、有无拖尾现象，并且可以用峰值分子量Mp值来大致看一下分子量情况。如果峰形很好，很对称、前面没有“鼓包”后面拖尾现象，那么说明色谱柱上的分离可能还是不错的，此时也可以用峰值分子量大致作参考。
另外，我了解的情况是，中检所那边的光散射好像是一些较低档次的产品吧？既不是真正的脱机的大型的光散射仪，也不是好的与GPC联机使用的光散射检测器，属于“展示品”，所以只能对分子量小于5万、10万的样品测一测还凑合，分子量越大，误差越大。超过1百万Dalton，多角外推法激光散射技术就不太适用了，小角激光就是优势明显了。
对于传统GPC，误差在10%以内其实是可以容忍的。本来就因为影响因素太多，近似于“瞎做”，您还能要求什么呢？呵呵，不过也别灰心，如果样品比较固定，就是那么一种或者几种，也比较干净，流动相/溶剂也比较好，那么重现性还是可以的。当然，这与操作者的实际操作水平有关。
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tigertooth
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2008/7/9 13:49:51 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1，楼上的那位说这么多一点也没有意义。多糖根本就没有单分散标样。
2，请先搞清楚高分子的角度依赖性和Zimm图再说小角好还是多角好。小角的能做Zimm图吗？小角检测器加池前过滤，经过过滤还能做多大分子量的样品？剪切作用后样品分子量降低了，那还是样品真正的分子量吗？
3，中检所的是18角的。
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