主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之七）

浏览0 回复2 电梯直达

一道黑

结帖率：

100%

关注：0 |粉丝：0

新手级：新兵

发表于：2008/11/25 07:55:54 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

HPLC在线紫外光谱检测和离线TLC确证猪肾中镇定药和咔唑心安残留
Tranquillizers and Carazolol – An HPLC Method with On-line UN Spectrum Identification and Off-line TLC Confimation for Residues in Pig Kidneys

安全操作与注意事项
有机溶剂：所有的有机溶剂都必须作为潜在的有害物对待，使用时必须在通风橱中进行。
稀释浓硫酸时要小心。

引言
镇定药和β-受体阻滞药咔唑心安被用于解决许多兽医实践中遇到的紧张情况。对残留量特别有影响的是在转移至屠宰场时防止猪死亡和猪肉变质时使用，从用药到屠宰一般不超过几个小时，这就可能导致在可食部分有高的残留量。
1. 主题内容
在整个EEC，许多镇定药和咔唑心安会在不同情况下使用。为了保证农场主在未经许可的情况下不用这些药物或者限制使用于产肉动物，可在屠宰场抽取肾脏样品，对此类化合物进行检测。不论何时有阳性检测结果，都必须进行确证。（见方法Cy 4.5和Cy 4.6）本方法按照残留指令(86/469/EEC)执行，并在荷兰的RIKILT-DLO进行。
2. 应用范围
本方法用于猪肾中6种镇定药和咔唑心安残留量的定量和确证。镇定药的检测限量为50μg/kg。氮哌酮形成的主要代谢物是氮哌醇，这两种化合物同时作为残留物。
3. 参考资料
委员会决议，93/256/EEC，规定的具有激素或甲状腺作用的物质的残留量的检测方法。〔OJ. No L. 118, 14.4.93, pp64-74〕
2052/VI/84 file 6.11 Ⅱ-4，科学兽医委员会，工作组－“残留量参考方法”，制订的残留量检测参考方法的一般规则。
ISO标准78/2-1982的第二部分: 化学分析标准
ISO标准5725 (1986)
Van Ginkel, L.A., Schwillens, P.L.W.J. and Olling, M., (1989), 液相色谱法在线紫外检测和离线薄层色谱法确证猪肾中的镇定药和咔唑心安残留量。Anal. chim. Acta. 225, 137-146
Haagsma, N., Bathelt, E.R. and Engelsma, J.W. (1988), 薄层色谱法检测猪肉组织中的镇定药氮哌酮、丙酰丙嗪和咔唑心安。J. Chrom. 436, 73-79。
4. 定义
镇定药或咔唑心安含量表示通过所述方法测得的肾中镇定药或咔唑心安的含量，以μg镇定药或咔唑心安/kg被测样品表示。
5. 原理
本方法包括4个步骤
－用乙醚提取碱性肾脏样品
－用硅基二醇柱净化
－用HPLC二极管阵列检测器分析和分级洗脱
－对HPLC分离物用TLC进行镇定药和咔唑心安的鉴别
6. 材料
6.1 化学试剂
注：除另有说明，化学试剂均为分析纯并来自Merck, 通过其他渠道得到的相似品质的试剂也可以使用。
6.1.1 乙酸乙酯
6.1.2 乙醇
6.1.3 氯仿
6.1.4 己烷
6.1.5 乙腈,HPLC级
6.1.6 氢氧化钠
6.1.7 乙醚
6.1.8 无水硫酸钠
6.1.9 低沸点石油醚，沸点40-60℃
6.1.10 浓硫酸
6.1.11 乙酸铵
6.1.12 丙酮
6.1.13 二氯甲烷
6.1.14 氨水
6.1.15 硝酸铋（Ⅲ价）
6.1.16 冰乙酸
6.1.17 碘化钾
6.1.18 香草醛
6.1.19 85％磷酸
6.2 溶液
6.2.1 乙腈：水（80：20 V/V）
6.2.2 乙腈：水（60：40 V/V）
6.2.3 乙腈：水（60：40 V/V）,含有0.1mol/L乙酸铵
6.2.4 乙腈：水：1mol/L乙酸铵（44.5：54.5：1，V/V/V）
6.2.5 TLC试剂
6.2.5.1 流动相Ⅰ；丙酮：二氯甲烷：25%氨水（40：60：1，V/V/V）
6.2.5.2 流动相Ⅱ；丙酮：25%氨水（100：0.1，V/V）
6.2.5.3 流动相Ⅲ；丙酮
6.2.6 TLC显色剂
6.2.6.1 Dragendorff试剂； 0.8g 硝酸铋（Ⅲ价）溶于10mL冰乙酸和40mL蒸馏水中，8g碘化钾溶于20mL蒸馏水中，将两种溶液混合后储于暗处。配制工作试剂时将6mL上述溶液与12mL冰乙酸、100mL乙醇（96%，V/V）和100mL乙醚混合，临用前现配。
6.2.6.2 香草醛－磷酸试剂；将3g香草醛溶于100mL乙醇中，然后边搅拌边加入75mL 85%磷酸、50mL蒸馏水和50mL乙醚。
6.2.6.3 硫酸试剂：加20mL浓硫酸于100mL乙醇中，冷却后再加20mL乙醚。
6.3 标准物质；氮哌酮和氟哌啶醇(Janssen Pharmaceutica) ；乙酰丙嗪(Clin Midy) ；氯丙嗪() ；丙酰丙嗪和甲苯噻嗪(Bayer)。
6.3.1 级分Ⅰ是浓度为2μg/L的氮哌酮和氮哌醇氯仿溶液。
6.3.2 级分Ⅱ是浓度为1μg/L的咔唑心安、氟哌啶醇和甲苯噻嗪氯仿溶液。
6.3.3 级分Ⅲ是浓度为1μg/L的乙酰丙嗪、丙酰丙嗪和氯丙嗪氯仿溶液。

0
赞贴
2
回帖
0
收藏
0
拍砖
版主
招募

为您推荐

近期热榜

热门活动

您可能想找: 气相色谱仪(GC) 询底价

选参数看心得找厂商查方案

专属顾问快速对接

立即提交

可能感兴趣

一道黑

禁止发帖修改昵称

ID：qingwenh

行业：其他

积分：0升级还需100积分

声望：0升级还需100声望

注册时间：0000-00-00

最后登录时间：0000-00-00

进入iLog 私信关注

结帖率：

100%

关注：0 |粉丝：0

新手级：新兵

2008/11/25 7:56:12 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

7. 仪器设备
7.1 玻璃仪器
普通范围的小型实验室玻璃仪器
7.2 仪器
7.2.1 Ultra-Turrax均质器
7.2.2 Buchli带真空泵的旋转蒸发仪
7.2.3 95℃水浴
7.2.4 45℃水浴，具有氮气吹扫
7.2.5 HAMILTON色谱用玻璃注射器
7.2.6 硅基二醇柱(Baker 70-9403)，提取前用3mL乙醇和3mL乙醚冲洗。
7.2.7 Baker 10 SPE系统
7.3 HPLC仪器
系统包括一个带有LKB 2152控制器的LKB2150泵，一个LKB 2212级分收集器，一个Hewlett Packard 1040A二极管阵列检测器，一个作为反相前置柱的Chromguard置换柱(10mmx3mm i.d.)和一个填充SAS-Hypersil (5μm) (Shandon)的分析柱(150mmx4.6mm i.d.)，溶剂6.2.4作为流动相，流速为2mL/min。在235nm处检测并分别收集3个洗脱级分，第一级分包括氮哌酮和氮哌醇，第二级分包括咔唑心安、甲苯噻嗪和氟哌啶醇，第三级分包括乙酰丙嗪、丙酰丙嗪和氯丙嗪。
7.4 TLC装置，包括展开槽、喷雾器、点样器
7.4.1 TLC色谱板，HPTLC-Fertigplatten Kieselgel-60 (Merck)型。
7.4.2 TLC色谱板用的70℃或120℃的热源。
8. 样品和样品制备
N.B. 请注意， ISO document 78/2-19826.3.1节，以及下面几条都来源于Annex Ⅱ, 2052/VI/84-EN。
8.1 样品性质：肾脏样品应该能够进行残留量的检测。
8.2 样品量：样品量应能满足按此方法进行检验并在必要的时候进行重复分析的需要。
8.3 肾脏样品抽取后必须马上冷却，在分析前的保存温度必须≤-20℃。
9. 操作步骤
9.1 解冻肾脏样品，去掉内容物。
9.2 在Ultra-Turrax中均质50g样品。
9.3 加4mL 5mol/L NaOH到20g均质样品中。
9.4 为了控制检测质量，将标准混合液加入没有用过镇定药和咔唑心安的猪（控制猪－空白样品）的肾脏样品中，在室温下至少放置30min，或者+4℃过夜。
9.5 所得悬浮液在95℃水浴中保温1h。
9.6 冷至室温，用70mL乙醚提取。
9.7 加入10g无水硫酸钠后过滤。
9.8 加入20mL低沸点石油醚（6.1.9）。
9.9 固相萃取。
9.9.1 用50mL漏斗将粗提取物加入柱中（7.2.6）。
9.9.2 用3mL乙醚，3mL乙醇，1mL乙腈：水（80:20 V/V），3 mL乙腈：水（60:40 V/V）洗涤。
9.9.3 用1.5mL含有0.1mol/L乙酸铵的乙腈：水（60:40 V/V）冲洗柱子，洗脱液收集在装有0.025mL 5mol/L NaOH溶液的试管中。
9.10 加入1mL丙酮后挥干溶剂。
9.11 将干的残留物溶解于0.1mL水后用2.5mL正己烷提取。将正己烷提取液挥发干后重新溶解在0.07mL HPLC洗脱液（6.2.4）中。
9.12 HPLC。在HPLC系统中进样0.055mL 9.11流动相。
用装有0.05mL 5mol/L NaOH溶液的3个试管收集7.3所述的3个级分。
9.13 用氮气流将各级分的体积浓缩至原来的一半。
9.14 用2X2mL乙醚提取各级分，加0.5g无水硫酸钠脱水后将乙醚挥干。
9.15 将0.4mL乙醇加入提取物中，保存在-20℃暗处，直至TLC分析。
9.16 TLC。检测系统基于Haagsma et., (1988)的工作。
9.16.1 将9.15提取液挥发干后溶解于0.05mL氯仿中，对每一级分在两块TLC色谱板(α&β)上点样0.015mL，在β板上点上0.005mL相应的标准溶液(6.3)。
9.16.2 第一级分提取液(see 7.3)在流动相Ⅰ (6.2.5.1)中预展，挥干，再在流动相Ⅲ(6.2.5.3)中展开，挥干，在Dragendorff试剂(6.2.6.1)中浸几秒钟。挥干2－5min后氮哌酮和氮哌酮的斑点显色出来，如果显色程度不够，可进行如下处理：将色谱板70℃加热5min，冷至室温后放入香草醛－磷酸溶液中，挥干10min后用紫外发光器的365nm光检查色谱板，镇定药变成可见的红色斑点。在70℃将色谱板加热5min可以加快这个过程。
9.16.3 第二级分提取液按同样的方法处理，除了用流动相Ⅱ(6.2.5.2)代替流动相Ⅲ。对咔唑心安的检测，在香草醛－磷酸溶液处理后的加热总是必需的，有时候还需要在120℃加热5min。
9.16.4 第三级分提取液在流动相Ⅰ中预展，挥干，在流动相Ⅱ中展开，挥干后在120℃加热1min。将色谱板在硫酸试剂(6.2.6.3)中浸几秒钟后在120℃加热4min。冷后将色谱板在Dragendorff试剂中浸几秒钟，挥干后镇定药变成可见的深褐色斑点。
10. 结果计算
HPLC上镇定药和咔唑心安在235nm处的检测限根据本手册section 5中的标准确定。例如，检测限等于对代表性空白样品测得的含量的平均值加上平均值的标准偏差的三倍。
基于二极管阵列检测系统的分辨限是这样定义的：在检测系统所能分辨的界限里，分析物谱图中的最大吸收波长应该与标准物质相同，对二极管阵列检测器一般在±2nm之间。分析物光谱图中相对吸光度＞10％标准物质吸光度的差异不应大于10%。当存在相同的最大吸收峰，并且两光谱图的最大吸收度的差异不超过标准物质吸收度的10%，该判据标准是符合的。文献Van Ginkel et al., (1989)中HPLC和TLC的检测限以及HPLC二极管阵列检测器的分辨限列于表1。
表1
化合物检测限(μg/kg) 分辨限(μg/kg) 回收率，n=6
HPLC TLC % SD(%)
氮哌醇＜1 1 2.5 64 4.4
氮哌酮＜1 1 2.5 60 2.3
咔唑心安＜1 0.3 1 56 7.5
甲苯噻嗪 2.5 3 10 31 7.0
氟哌啶醇 2.5 6 10 59 6.0
乙酰丙嗪 5 0.3 10 55 3.9
丙酰丙嗪 5 0.3 10 61 11
氯丙嗪 10 0.3 25 59 11
10.1 回收率
文献（Van Ginkel et al., 1989)报道了添加浓度为检测限的1－5倍时测得的镇定药和咔唑心安的回收率（见表1）。这些物质的回收率是由它们的相对UV吸光度计算来的，这些数值相当于HPLC级分的实际回收率，没有进行等分因子校正。除甲苯噻嗪外，所有的回收率都在55－64％之间，甲苯噻嗪的低回收率是由SPE柱的不完全洗脱引起的。
11. 特殊情况
12. 操作注意事项
13. 样品控制
14. 试验报告
15. 缩写词列表
见手册Section 12中Annex Ⅰ的缩写词。
16. 检验流程图
均质肾脏→碱消化→用乙醚提取→SPE净化→HPLC→TLC→结果。

赞贴

拍砖