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主题：【讨论】土壤DNA提取及细菌16S rDNA PCR扩增问题，寻求大家帮助！急！

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chengjianzhong
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发表于：2009/10/19 14:58:38 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊


我用MO Bio的soil DNA Isolation Kit提取土壤总DNA，提取的DNA直接跑胶，看不见任何条带，采用细菌16S rDNA通用引物（27F和1492R)进行PCR扩增，也没有结果，有一次我将试剂盒提取的DNA50倍稀释后，进行细菌16S rDNA的PCR扩增，扩增出了目的条带，我所用的酶为Takara的LA Taq，用普通的Taq酶扩增不出来，但隔了一周后再去重复，什么条件都一样，却再也扩不出来了，我重新提取了新的DNA进行PCR,依然没有结果，不知道是什么原因，请大家帮忙分析一下，希望有做过土壤微生物多样性的高手提供点提取土壤DNA以及扩增细菌16S rDNA的实验方法，我将不胜感激！我现在非常着急！希望能尽快得到大家的帮助！
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2010/3/24 14:15:02 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
土壤里面腐殖酸含量比较高，纯化过程也很难完全去除掉，这个对PCR会有抑制，所以稀释后腐殖酸浓度也降低了，就能P出来；但跑胶没有条带但稀释后却能P出来还是挺奇怪的～
PCR的成功率本来就不是100%，影响因素很多，有的时候是完全想不到的因素导致的P不出来，还是要多做，摸索出最优条件才能提高点成功率，不过P不出来的时候还是挺痛苦的～
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