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液相色谱（LC）

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主题：【讨论】三部药典甘氨酸含量测定的技术帖

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青林

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发表于：2010/03/25 16:36:10 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

三部药典新增甘氨酸含量测定的实验，有哪位大侠做过这个实验，教下经验？方法如下；

本法系依据过量的6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）在一定条件下和氨基酸形成稳定的衍生产物（柱前衍生），用高效液相色谱法测定衍生产物，根据衍生产物的含量计算甘氨酸含量。
照高效液相色谱法（附录III B）测定
色谱条件和系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为基质的C18反相色谱柱，颗粒度4μm，内径3.9mm,柱长150mm；柱温为37℃;以140mmol/L乙酸钠、17mmol/L三乙胺pH 5.65、1μg/mlEDTA二钠盐为流动相A液，以100%乙腈为流动相B液，以纯水为流动相C液,流速为每分钟1.0ml，梯度洗脱32分钟（见梯度表），检测波长为248nm。甘氨酸与相邻色谱峰之间分离度应≥1.5；拖尾因子（T）为0.95～1.40之间(甘氨酸和α-氨基丁酸峰)。重复性RSD≤2.0%（甘氨酸对照品峰面积测量值）。

内标溶液的制备精密称取α-氨基丁酸对照品 4.0g, 加超纯水至100ml定容。

对照品溶液的制备 (1)精密称取甘氨酸标准 2.5g加超纯水至100ml定容。(2) 精密量取(1)项氨基酸标准溶液1.0ml，加9.0ml 1.5%磺基水扬酸，混匀静置2小时以上3000rpm离心10分钟，留取上清备用。①分别精密量取上清液50μl、100μl、125μl、150μl、200μl，置10ml容量瓶中，用纯水定容。②分别精密量取①项中各甘氨酸标准溶液0.1 ml，加0.4ml纯水，加内标0.02ml混匀备用。精密量取(2)②项甘氨酸标准溶液10μl放入衍生管中加70μl硼酸缓冲液(pH8～10)涡旋混和并加入20μl AQC衍生剂涡旋混和15秒，备用。

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2010/3/25 16:36:27 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

供试品溶液的制备精密量取供试品溶液1.0ml，加9.0ml 1.5%磺基水扬酸，混匀静置2小时以上3000rpm离心10分钟，留取上清备用。（1）精密量取离心上清液1.0ml，置10ml容量瓶中，用纯水定容。（2）精密量取（1）项中供试品溶液0.1 ml，加0.4ml纯水，加内标0.02ml混匀备用。精密量取(2)项供试品溶液10μl放入衍生管中加70μl硼酸缓冲液涡旋混和并加入20μl AQC衍生剂涡旋混和15秒, 备用。

测定法精密量对照品溶液与供试品溶液,分别注入液相色谱仪，记录色谱图32分钟。进样量为10μl。按内标法计算。

时间	流速	A液	B液	C液	曲线
分钟	ml/min	%	%	%
起始	1	100	0	0	*
0.5	1	99	1	0	瞬时
18	1	95	5	0	线性
19	1	91	9	0	线性
22	1	83	17	0	线性
25	1	0	60	40	瞬时
28	1	100	0	0	瞬时
32	1	100	0	0	线性

附注： (1)甘氨酸含量测定应采用柱前衍生及内标法,除本法要求外衍生剂也可选用异硫氰酸苯酯（PITC）, 邻苯二甲醛(OPA);内标物也可选用正缬氨酸; C18反相色谱柱的颗粒度也可选用5μm或亚二微米。根据液相色谱系统、C18反相色谱柱规格、衍生剂及内标物的不同可以调整相应的色谱条件。

(2)直线回归相关系数应不低于0.999。

(3)系统适应性中重复性可用其它适宜方法。

（4）本法也适用于血液制品中组氨酸和精氨酸测定，仅对照品改为相应的组氨酸或精氨酸。

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2010/3/25 16:39:05 Last edit by wyqql2060