主题：【原创】【第三届原创参赛】HPLC法同时测定益心舒片中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和丹参酮ⅡA的含量

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发表于：2010/09/28 15:50:01 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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HPLC法同时测定益心舒片中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和丹参酮ⅡA的含量

摘要：目的 建立HPLC法同时测定益心舒片中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和丹参酮ⅡA的含量。方法采用Phenomenex Kinetex C₁₈柱，以乙腈-水梯度洗脱，流速1ml/min，柱温30℃，检测波长250nm。结果五味子醇甲在0.2156～2.1560μg（r=0.9999），五味子酯甲在0.0650～0.6500μg(r=0.9999)，五味子甲素在0.0346～0.3460μg(r=0.9999)，五味子乙素在0.0692～0.6920μg(r=0.9999)，丹参酮ⅡA在0.0240～0.2400μg(r=0.9999)范围内呈良好的线性关系，平均回收率五味子醇甲为97.92％，RSD为2.34%（n=6）；五味子酯甲为100.28％，RSD为2.57%（n=6）；五味子甲素为98.34％，RSD为2.73%（n=6）；五味子乙素为98.06％，RSD为1.61%（n=6）；丹参酮ⅡA为99.13％，RSD为1.42%（n=6）；结论本法简便，灵敏度高，重现性好，可用于益心舒片的质量控制。

关键词：益心舒片；五味子醇甲；五味子酯甲；五味子甲素；五味子乙素；丹参酮ⅡA；HPLC法

Determination of Schizandrin ,Schisantherin, Deoxyschizandrin , γ-Schishandrin and Tanshinone ⅡA in Yixinshu Tablet by HPLC

QIN Qian-ping，WU Jian-xiong， BI Yu-an，LIN Xia,WANG Zhen-zhong,XIAO Wei

(Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.Ltd, Lianyungang 222001,China )

Abstract : Objective To establish a HPLC method for the determination of Schizandrin ,Schisantherin, Deoyschizandrin ,γ-Schishandrin and Tanshinone ⅡA in Yixinshu tablet. Methods The Phenomenex Kinetex C₁₈ column was used with a mobile phase of acetonitrile-water gradient elution,the flow rate was 1ml/min,the column temperature was 30℃,the detection wavelength was 250nm. Results The linear ranges of Schizandrin ,Schisantherin, Deoxyschizandrin ,γ-Schishandrin and TanshinoneⅡA were 0.2156～2.1560μg（r=0.9999），0.0650～0.6500μg (r=0.9999)，0.0346～0.3460μg (r=0.9999) , 0.0692～0.6920μg (r=0.9999) and 0.0240～0.2400μg (r=0.9999) respectively.The average recoveries of five components were 97.92％，100.28％，98.34％，98.06％ and 99.13％.Conclusion The method is simple ，sensitive and repeatable.It can be a method for quality control of Yixinshu tablet.

Key words:Yixinshu tablet; Schizandrin; Schisantherin; Deoxyschizandrin;

γ-Schishandrin; Tanshinone ⅡA ; HPLC

益心舒片处方由人参、丹参、五味子等药组成，其中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素为五味子中的主要有效成分，丹参酮ⅡA是丹参的主要有效成分。为了更好的控制产品质量，保证临床疗效，本文参照药典^[1]及文献^{[2] [3]}，建立了HPLC法测定益心舒片制剂中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和丹参酮ⅡA的含量，方法可靠、灵敏、快速。

1 仪器和试药

Waters 2695高效液相色谱仪；Waters 2487检测器；五味子醇甲（批号：110857-200709），五味子酯甲（批号：111529-200803），五味子甲素（批号：110764-200609），五味子乙素（批号：110765-200508），丹参酮ⅡA（批号：110766-200616），对照品均购自中国药品生物制品检定所；乙腈（色谱纯），水（超纯水），其余试剂均为分析纯。益心舒片（江苏康缘药业股份有限公司生产）。

2 方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Phenomenex Kinetex 2.6µ C18 100A(100*4.6mm)；流动相：乙腈（A）-水溶液（B）梯度洗脱，线性洗脱程序为0～35min 30%→70%（A）；流速：1ml/min；柱温：30℃；测定波长：250nm；进样量：10μl；理论塔板数以五味子醇甲峰计，不得低于4000。

2.2 对照品溶液的制备

取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定,加甲醇制成每1ml含五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和丹参酮ⅡA分别为44μg、15μg、15μg、8μg和6μg的混合对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品10片，除去薄膜衣，研细，取约1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，超声(功率 250W,频率 40kHz) 提取40分钟,放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系的考察

精密称取对照品五味子醇甲21.56mg、五味子酯甲6.50mg、五味子甲素3.46mg、五味子乙素6.92mg和丹参酮ⅡA 2.40mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和丹参酮ⅡA浓度分别为431.20μg/ml、130.00μg/ml、69.20μg/ml、138.40μg/ml和48.00μg/ml的标准品储备液。分别精密量取上述溶液0.5ml，1.0ml，2.0ml，4.0ml，5.0ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X），绘制标准曲线。结果见表1。表1 线性范围、回归方程和相关系数

Tab1 Results of linear ranges,regression equations and correlation coefficients

成分	线性范围（μg）	回归方程	相关系数r
五味子醇甲	0.2156～2.1560	Y=33328X+19388	r=0.9999
五味子酯甲	0.0650～0.6500	Y=24524X-10302	r=0.9999
五味子甲素	0.0346～0.3460	Y=40977X-11022	r=0.9999
五味子乙素	0.0692～0.6920	Y=32190X-23084	r=0.9999
丹参酮ⅡA	0.0240～0.2400	Y=70100X-44948	r=0.9999

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液 (五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和丹参酮ⅡA浓度分别为43.12μg/ml、16.60μg/ml、6.48μg/ml、14.92μg/ml和5.18μg/ml) 10μl，注入液相色谱仪，重复进样6次，测得峰面积，计算RSD。五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和丹参酮ⅡA峰面积的RSD分别为2.41%、2.48%、2.23%、2.34%和2.47%。结果表明精密度良好。

2.6 稳定性试验

取本品（批号：090501）10片，除去包衣，研细，取约1g，精密称定。按供试品溶液制备项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl，分别于第0、2、4、6、9、12小时注入液相色谱仪，测得峰面积，计算RSD。五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和丹参酮ⅡA峰面积的RSD分别为1.10%、1.36%、0.99%、1.54%和1.24%。结果表明，供试品溶液在12小时内稳定。

2.7 重复性试验

取本品（批号：090501）10片，除去包衣，研细，取约1g，精密称定。按供试品溶液制备项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，测定，计算含量，结果五味子醇甲平均含量为0.15mg/片，RSD为1.03%；五味子酯甲平均含量为0.036mg/片，RSD为2.96%；五味子甲素平均含量为0.019mg/片，RSD为2.88%；五味子乙素平均含量为0.043mg/片，RSD为2.96%；丹参酮ⅡA平均含量为0.014mg/片，RSD为2.66%。结果表明本方法重复性良好。

2.8 回收率试验

取本品（批号：090501，含量：五味子醇甲为0.15mg/片，五味子酯甲为0.036mg/片，五味子甲素为0.019mg/片，五味子乙素为0.043mg/片，丹参酮ⅡA为0.014mg/片。），除去包衣，研细，取6份，每份约0.5g，精密称定，分别精密加入含五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和丹参酮ⅡA为2160μg/ml、679.0μg/ml、346.0μg/ml、662.0μg/ml和148.0μg/ml的混合对照品溶液1ml，然后精密加入甲醇9ml,按供试品溶液制备项下方法制备供试品溶液，进行含量测定，并计算回收率。结果见表2。

表2 回收率测定结果（n=6）

Tab 2 Results of recovery

成分	平均回收率（%）	RSD（%）
五味子醇甲	97.93％	2.34%
五味子酯甲	100.29％	2.57%
五味子甲素	98.34％	2.73%
五味子乙素	98.05％	1.61%
丹参酮ⅡA	99.08％	1.42％

2.9 样品含量的测定

取3批益心舒片样品，制备供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，计算，结果见表3.

表3 样品测定结果(n=3)

Tab 3 Results of content determination of the samples

成分批号

090501

090502

090503

五味子醇甲（mg/片）

0.15

0.16

五味子酯甲（mg/片）

0.036

0.042

0.037

五味子甲素（mg/片）

0.019

0.021

0.022

五味子乙素（mg/片）

0.043

0.046

0.047

丹参酮ⅡA（mg/片）

0.014

0.017

0.015

3 讨论

3.1在供试品溶液的制备时，考虑到指标成分的提取率，以及其他成分对含量测定的影响，考察了提取溶媒乙醇、甲醇、80%甲醇、70%乙醇、50%甲醇和50%乙醇，比较了超声提取和回流提取的效果。结果表明采用甲醇超声处理提取效果较好。

3.2本文采用HPLC法进行五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和丹参酮ⅡA的含量测定，比较了甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸溶液^[4]三种流动相系统的分离效果，结果采用乙腈-水溶液分离效果较好。比较了检测波长^{[4] [5]}，结果表明250nm处，各峰峰形良好，基线平稳，分离度高。比较了Phenomenex Kinetex C18柱、Phenomenex Luna C18柱和Kromasil C18柱，结果Phenomenex Luna C18柱和Kromasil C18柱未能使本文中所检测的5个成分均达到基线分离，快速分离柱Phenomenex Kinetex C18柱能较好的分离本品中上述5个成分。

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