主题：【原创】对LC的认识(1)

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发表于：2010/10/02 11:43:00 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

看到大家都比较喜欢在论坛上分享自己的经验，我这个平常只浏览帖子的人也忍不住想写写东西，但又害怕水平有限，望大家多多包含。
分析给我最大的认识是：必须得有自己的想法，必须会动脑，否则你做起实验来仅仅是个操作机器人（这点最重要）。好了，下面直接说我的认识：
首先，要用LC测定一个物质，首先得对这个物质的物理、化学性质有个清醒的认识。像溶解度，PKA值，物质的官能团都是需要了解的。这里不说像蛋白质，氨基酸等等这些大分子的分析方法，因为它们有专门的分析柱分析。我想说的是对于一般的有机物的分析，因为它们大多数是可以用C18分离的。这些物质无外乎就是有机酸或者有机碱，记住很重要的一点，有机酸分析时加酸抑制电离；有机碱根据极性和疏水性来判断是加酸还是加碱，如果它的极性大，在柱子上难保留，那就需要加酸，目的是让目标物结合质子，和离子对试剂形成缔合物在柱子上保留，在这里我强烈推荐三氯乙酸或者三氟乙酸，我认为它们不仅起到酸的作用，而且起到了部分离子对试剂的作用。如果它的极性小，很容易在柱子上保留，并且可能会有次级保留，那么一般是需要加点扫尾剂三乙胺的。
其次，关于洗脱程序的设定。等度没什么好说的，我想强调下保留时间。一般洗脱是要保证目标物的保留因子K在0.5-20的范围内，所以保留时间不能太长，超过了60min说明你这个洗脱程序是失败的（针对分析而言）。梯度洗脱就要好好理解了，因为组成复杂的样品一般都要用到，记住梯度洗脱时最重要的一点：开始的梯度设置的尽量缓一些，目的是为了使那些保留因子小的组分能够很平稳的洗脱出来，得到比较好的峰型与分离度，后面的梯度可以尽量设置的陡一些，目的是使那些保留因子大的组分能够较快的出峰，当然要兼顾分离度，因为如果太迟出峰的话会使得峰型很差，柱效下降，灵敏度变差。这是因为保留时间太长，导致组分在柱子中展宽的机会增多，使得峰展宽严重。我个人的经验是等度梯度混合使用比较好，一般保留比较弱的组分设置等度就能分离得比较好，要想设置一个有效的梯度，“三倍规则”和“用等度还是梯度判断原则”还是要好好了解下。
第三，一些LC分析的经验。如果用紫外检测器检测话，目标的摩尔吸光系数大于5000响应会比较好，用缓冲盐磷酸盐是个不错的选择，因为它紫外背景吸收小，达到同样PH值所需要的量少（相比醋酸而言），另外还要注意流动相溶剂的截止波长，总之有很多经验可言，我就不一一细说了。

该帖子作者被版主 月旭科技--小S加 10积分， 2经验，加分理由：非常宝贵的分享！感谢！