主题：【分享】高效液相色谱知识普及

（六）、高效液相色谱的分类
1、吸附色谱Adsorption Chromatography
用固体吸附剂作固定相，以不同极性溶剂做流动相依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。
2、分配色谱Partition Chromatography
用载带在固相基体上的固定液做固定相，以不同极溶剂作流动相。依据样品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。
3、离子色谱Ion Chromatography
用高效微粒离子交换剂作固定相，以具有一定PH值的缓冲液做流动相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆离子交换能力的差别来实现分离。
4、体积排阻色谱Size Exclusion Chromatography
用化学惰性的多孔性凝胶做固定相，按固定相对样品中组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。又分：
a、Gel Filtration Chromatography（GFC）以水为流动相的体积排阻色谱
b、Gel Permeation Chromatography（GPC）以有机溶剂为流动相的体积排阻色谱
5、亲和色谱
以在不同基体上，键合多种不同特性的特性的配位体做固定相用具有不同PH值的缓冲溶液作流动相，依据生物分子（氨基酸、肽、蛋白质、核碱、核酸、核苷酸、酶等）与基体上键合的配位体之间存在的特异性亲和作用能力的差别而实现对具有生物活性的生物分子的分离。

（七）、什么样品目前不能用液相色谱分离
1、保留值大于相当于炭数为85的正构烷烃的保留值的同系物
2、保留值大于相当于炭数为35的正构烷烃的保留值的烷烃同系物的混合物。
3、对于链状化合物的非极性位置异构体如烃类一般不能用液相色谱分离。
4、对于间位、对位位置不同的非极性取代基的芳香异构体不能分离，特殊色谱柱可以分离。
5、对于给定的柱系统中如果两相邻炭数的同系物之间的峰数大于其间的峰容量。
正相色谱法与反相色谱法比较表
正相色谱法 反相色谱法
固定相极性 高～中 中～低
流动相极性 低～中 中～高
组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出
高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较
高效液相色谱法 经典液相色谱法
色谱诸：柱长/cm
柱内径/mm 10~25
2~10 10~200
10~50
固定相颗粒：粒经/um
筛孔/目 5~50
2500~300 75~600
200~30
色谱柱入口压力/MPa 2~20 0.001~0.1
柱效（理论塔版数） 2*103~5*104 2~50
进样量/g 10-6~10-2 1~10
分析时间/h 0.05~1.0 1~20
高效液相色谱法与气相色谱法的比较
高效液相色谱法 气相色谱法
进样方式 样品制成溶液 样品需加热气化或裂解
流动相 液相流动相可为离子型、极性、弱极性、非极性溶液。可与被分析样品产生相互作用并能改善分离的选择性。
液体流动相动力粘度为10-3Pa.s输送压力高达2~20 Mpa。 气相流动相为惰性气体，不与被分析的样品发生相互作用。
气相流动相动力粘度为10-5Pa.s输送压力高达0.1~0.5Mpa。
固定相 分离机理：
依据吸附、分配、筛析、离子交换、亲和等多种原理进行分离。供选择的固定相种类繁多。
色谱柱：
固定相粒度小为5~10um，填充柱内经3~6mm柱长10~25 cm。柱效103~104。毛细管柱内经为0.01~0.03mm，柱长5~10m。柱效104~105。柱温为常温。 分离机理：
依据吸附、分配两种原理进行分离。供选择的固定相种类较多。
2、色谱柱：
固定相粒度大0.1~0.5mm，填充柱内经为1~4mm柱长为1~4 cm。柱效为102~103。毛细管柱内经为0.1~0.3mm，柱长为10~100m。柱效为103~104。柱温为常温~300℃。
检测器 选择型检测器：
UVD、PDAD、FD、ECD
通用型检测器：
ELSD、RID 选择型检测器：
NPD、FPD、ECD
通用型检测器：
TCD、FID（有机物）
应用范围 低分子量低沸点样品、高沸点中分子、高分子有机化合物、离子型无机化合物、热不稳定性有生物活性的生物分子。 低分子量低沸点有机化合物、永久性气体、配合程序升温可分析高沸点有机化合物、配合裂解技术可分析高聚物。
UVD：紫外吸收检测器PDAD：二极管阵列检测器
FD：荧光检测器ECD：电化学检测器
ELSD：蒸发激光散射检测器RID：折光指数检测器
NPD：氮磷检测器FPD：火焰光度检测器
ECD：电子捕获检测器FID：氢火焰离子化检测器
TCD：热导池检测器

高效液相色谱仪的特点
优点：
1、分离性能高：由于新型高效微粒固定相填料的使用，液相色谱柱理论塔版数可高达2*103~5*104块/米，远高于气相色谱。
2、选择性高：由于液相色谱具有高柱效并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性，因此高效液相色谱仪不仅可以分析不同类型有机化合物及其同分异构体，还可分析性质上极为相似的旋光异构体。
3、检测灵敏度：紫外可到10-9 g/l荧光可到10-12 g/l
4、分析速度快：一般几分钟到几十分钟。
缺点：
1、成本高
2、易污染环境
3、缺少通用型检测器
4、不能代替气相
5、不能代替中低压柱色谱法

四、泵的使用和维护注意事项
为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作：
a.防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是滤过，可采用滤膜（0.2um或0.45um）等滤器。泵的入口都应连接砂滤棒（或片）。输液泵的滤器应经常清洗或更换。
b.流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。
c.泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。
d.输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。
e.流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。
故障排除：
a.没有流动相流出，又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵在较大流量（如5ml/min）下运转，将气泡排尽，也可用一个50ml针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损，需更换。
b.压力和流量不稳。原因可能是气泡，需要排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞，这时，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。
c.压力过高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。检查堵塞或泄漏时应逐段进行。
梯度洗脱
梯度洗脱：是用两种或多种不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度配比和极性通过流动相极性的变化来改变被分离样品的选择因子a值和保留时间，以使柱系统具有最好的选择性和最大的峰容量。采用梯度洗脱可以提高分离度缩短分析时间降低最小检测量和提高分析精度。梯度洗脱对于复杂混合物特别是保留性能相差较大的混合物的分离是极为重要的手段。
HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。
梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）。
两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。
在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：
a.要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。
b.梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。
c.混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。
d.每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让10~30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。

五、检测器
检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。HPLC的检测器要求灵敏度高、噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感）、线性范围宽、重复性好和适用范围广。
1．分类
1）按原理可分为光学检测器（如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射）、热学检测器（如吸附热）、电化学检测器（如极谱、库仑、安培）、电学检测器（电导、介电常数、压电石英频率）、放射性检测器（闪烁计数、电子捕获、氦离子化）以及氢火焰离子化检测器。
2）按测量性质可分为通用型和专属型（又称选择性）。通用型检测器测量的是一般物质均具有的性质，它对溶剂和溶质组分均有反应，如示差折光、蒸发光散射检测器。通用型的灵敏度一般比专属型的低。专属型检测器只能检测某些组分的某一性质，如紫外、荧光检测器，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应。
3）按检测方式分为浓度型和质量型。浓度型检测器的响应与流动相中组分的浓度有关，质量型检测器的响应与单位时间内通过检测器的组分的量有关。
4）检测器还可分为破坏样品和不破坏样品的两种。
2．性能指标
1）噪音和漂移：在仪器稳定之后，记录基线1小时，基线带宽为噪音，基线在1小时内的变化为漂移。它们反映检测器电子元件的稳定性，及其受温度和电源变化的影响，如果有流动相从色谱柱流入检测器，那么它们还反映流速（泵的脉动）和溶剂（纯度、含有气泡、固定相流失）的影响。噪音和漂移都会影响测定的准确度，应尽量减小。
2）灵敏度(sensitivity)：表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。对浓度型检测器，它表示单位浓度的样品所产生的电信号的大小，单位为mVml/g。对质量型检测器，它表示在单位时间内通过检测器的单位质量的样品所产生的电信号的大小，单位为mVs/g。
3）检测限(detection limit)
检测器灵敏度的高低，并不等于它检测最小样品量或最低样品浓度能力的高低，因为在定义灵敏度时，没有考虑噪声的大小，而检测限与噪声的大小是直接有关的。
检测限指恰好产生可辨别的信号（通常用2倍或3倍噪音表示）时进入检测器的某组分的量（对浓度型检测器指在流动相中的浓度--注意与分析方法检测限的区别，单位g/ml或mg/ml；对质量型检测器指的是单位时间内进入检测器的量，单位g/s或mg/s）。又称为敏感度(detectability)。D＝2N/S，式中N为噪声，S为灵敏度。通常是把一个已知量的标准溶液注入到检测器中来测定其检测限的大小。
检测限是检测器的一个主要性能指标，其数值越小，检测器性能越好。值得注意的是，分析方法的检测限除了与检测器的噪声和灵敏度有关外，还与色谱条件、色谱柱和泵的稳定性及各种柱外因素引起的峰展宽有关。
4）线性范围(linear range)：指检测器的响应信号与组分量成直线关系的范围，即在固定灵敏度下，最大与最小进样量（浓度型检测器为组分在流动相中的浓度）之比。也可用响应信号的最大与最小的范围表示，例如Waters 996 PDA检测器的线性范围是-0.1~2.0A。
定量分析的准确与否，关键在于检测器所产生的信号是否与被测样品的量始终呈一定的函数关系。输出信号与样品量最好呈线性关系，这样进行定量测定时既准确又方便。但实际上没有一台检测器能在任何范围内呈线性响应。通常A＝BCx，B为响应因子，当x=1时，为线性响应。对大多数检测器来说，x只在一定范围内才接近于1，实际上通常只要x=0.98~1.02就认为它是呈线性的。
线性范围一般可通过实验确定。我们希望检测器的线性范围尽可能大些，能同时测定主成分和痕量成分。此外还要求池体积小，受温度和流速的影响小，能适合梯度洗脱检测等。
5）池体积：除制备色谱外，大多数HPLC检测器的池体积都小于10ul在使用细管径柱时，池体积应减少到1~2ul甚至更低，不然检测系统带来的峰扩张问题就会很严重。而且这时池体、检测器与色谱柱的连接、接头等都要精心设计，否则会严重影响柱效和灵敏度。
3．紫外检测器(ultraviolet detector)
UV检测器是HPLC中应用最广泛的检测器，当检测波长范围包括可见光时，又称为紫外-可见检测器。它灵敏度高，噪音低，线性范围宽，对流速和温度均不敏感，可于制备色谱。由于灵敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系数低的物质也可用UV检测器进行微量分析。但要注意流动相中各种溶剂的紫外吸收截止波长。如果溶剂中含有吸光杂质，则会提高背景噪音，降低灵敏度（实际是提高检测限）。此外，梯度洗脱时，还会产生漂移。
注：将溶剂装入1cm的比色皿，以空气为参比，逐渐降低入射波长，溶剂的吸光度A＝1时的波长称为溶剂的截止波长。也称极限波长。
中国药典对UV法溶剂的要求是：以空气为空白，溶剂和吸收池的吸收度在220~240nm范围内不得超过0.40，在241~250nm范围内不得过0.20，在251~300nm范围内不得过0.10，在300nm以上不得过0.05。
UV检测器的工作原理是Lambert-Beer定律，即当一束单色光透过流动池时，若流动相不吸收光，则吸收度A与吸光组分的浓度C和流动池的光径长度L成正比：
A＝lg＝lg＝ECL
式中I0为入射光强度，I为透射光强度，T为透光率，E为吸收系数。
UV检测器分为固定波长检测器、可变波长检测器和光电二极管阵列检测器(photodiode array detector，PDAD)。按光路系统来分，UV检测器可分为单光路和双光路两种。可变波长检测器又可分单波长（单通道）检测器和双波长（双通道）检测器。PDAD是80年代出现的一种光学多通道检测器，它可以对每个洗脱组分进行光谱扫描，经计算机处理后，得到光谱和色谱结合的三维图谱。其中吸收光谱用于定性（确证是否是单一纯物质），色谱用于定量。常用于复杂样品（如生物样品、中草药）的定性定量分析。
检测器性能指标
紫外 质谱 蒸发光散射 示差 荧光 电导
测量参数 吸光度
（A） 离子流强度 散射光强 折光指数（RIU） 荧光强度（Au） 电导率
（Us/cm）
池体积 1-10 -- -- 3-10 3-20 1-3
类型 选择型 通用型 通用型 通用型 选择型 选择型
线性范围 105 宽 -- 104 103 104
最小检测浓度g/ml 10-10 ＜10-9g/s 10-9 10-7 10-11 10-3
最小检测量 ︽1ng  ︽1ug ︽1pg ︽1mg
躁声 10-5 -- -- 10-7 10-3 10-3
用于梯度细脱 可以 可以 可以 不可 可以 不可
对流量敏感性 不敏感 不敏感 -- 敏感 不敏感 敏感
对温度敏感性 低 -- 小 10-4℃ 低 2%/℃
时间常数TC：时间常数越大对信号峰损害越大。峰也越胖。我们需要高而瘦的峰为理想指标。
HPLC选择型检测器UVD PDAD FD ECD
HPLC通用型检测器ELSD RID

4．与检测器有关的故障及其排除
1）流动池内有气泡
如果有气泡连续不断地通过流动池，将使噪音增大，如果气泡较大，则会在基线上出现许多线状“峰”，这是由于系统内有气泡，需要对流动相进行充分的除气，检查整个色谱系统是否漏气，再加大流量驱除系统内的气泡。如果气泡停留在流动池内，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的办法除去气泡（最好不连接色谱柱）；或者启动输液泵的同时，用手指紧压流动池出口，使池内增压，然后放开。可反复操作数次，但要注意不使压力增加太多，以免流动池破裂。
2）流动池被污染
无论参比池或样品池被污染，都可能产生噪音或基线漂移。可以使用适当溶剂清洗检测池，要注意溶剂的互溶性；如果污染严重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鲜溶剂冲洗，或者取出池体进行清洗、更换窗口。
3）光源灯出现故障
紫外或荧光检测器的光源灯使用到极限或者不能正常工作时，可能产生严重噪音，基线漂移，出现平头峰等异常峰，甚至使基线不能回零。这时需要更换光源灯。
4）倒峰
倒峰的出现可能是检测器的极性接反了，改正后即可变成正峰。用示差折光检测器时，如果组分的折光指数低于流动相的折光指数，也会出现倒峰，这就需要选择合适的流动相。如果流动相中含有紫外吸收的杂质，使用紫外检测器时，无吸收的组分就会产生倒峰，因此必须用高纯度的溶剂作流动相。在死时间附近的尖锐峰往往是由于进样时的压力变化，或者由于样品溶剂与流动相不同所引起的。

六、进养阀故障
1、转子密封表面出现划痕后，通常可能有如下4种泄漏现象：
a．在取样位置，5＃孔和6＃孔之间的划痕不会产生高压渗漏。但当转至进样位置时，此时划痕位于1＃孔和6＃孔之间，液体就会从6＃样品溢出管排出。
b．当处于进样位置时，如2＃孔和3＃孔之间有划痕，则不会有液体渗漏到系统外，但实际上此时形成了样品定撞管的旁流路。当转到取样位置时，此时划痕位于1＃孔和2＃孔之间，这时液体会从6＃样品溢出管或从进样针导入口流出。
c．在进样位置，如3＃孔和4＃之间有划痕，取样和进样位置均会发生液体渗漏。
d．在取样位置，如4＃孔和5＃孔之间有划痕，在取样和进样位置都不会发生渗漏；但是如果样品定量管阻力很大，而且样品扩散很快，取样时部分样品会从旁路流失。
2、进样阀漏液
进样阀漏液是液相色谱最常见的故障。进样阀经常出现漏液的地方有进样针导入口、放空管和靠近进样阀定子的间隙。进样阀漏液大部分是因为进样阀的转子密封受到损坏造成的(这种情况下，如要修复就必须更换损坏的转子密封)，但也有相当多的漏液是由于其他原因造成的(这种情况下只需要简单地调整进样阀即可修复)。进样阀转子密封受到损坏的原因绝大部分是固体杂质划伤其表面。这些固体杂质可能来源于样品、流动相或缓冲液中盐的结晶。当然所使用的金属连接管和零配件上未清洗净的金属末同样可造成上述麻烦。
3、解决进样阀漏液的方法：
a.液体只是当进样阀处在取样位置时沿着进样针导人口流出。仔细地将进样器针头慢慢插入进样针导人口，并感觉针头所受到的摩擦阻力变化情况。正常情况下，当进样针头最后3mm左右进入进样阀时，能感觉到摩擦阻力在逐渐增加。但在进样器针头进入进样阀后，出现没有感觉到摩擦阻力有任何变化，针头就插到底的现象时，情况就不正常了。出现这种不正常情况的原因有两种，一是进样阀内转子密封上的针头密封松了，二是进样阀内转子密封上针头密封的孔径改变太大，使得转子密封上的针头密封不能够完全密封住进样器针头，当然也就不能防止液体回流。因此，所进的部分或全部样品便沿着进样器的针头，通过进样针导人口流出。解决因针头密封松了而出现漏液问题的方法很简单，找一支带橡皮的铅笔，用铅笔的橡皮端将进样针导人口向进样阀内推，以压紧转子密封上的针头密封。解决针头密封孔径改变太大而致的漏液问题的方法，一是可以将转子密封从进样阀中卸出，利用合适的工具修复转子密封上针头密封的孔径；二是直接更换一个新的转子密封。
在上述观察、判断和解决问题的全过程中，有几点需要注意：
a．进样器的针头在插入进样阀的过程中，针头的前大半段(长度约为4.5cm)进入时，因尚未接触到转子密封上的针头密封，所以插入非常轻松，几乎没有什么摩擦阻力。当针头进入并插入转子密封上的针头密封(即针头最后3mm左右进人进样阀)时，明显感觉摩擦阻力增加。
b．当进样阀上的6＃放空管被缓冲溶液中的盐结晶堵塞时，会使转子密封上的针头密封变松，因此请首先检查6＃放空管。
c．使用错误型号和尺寸的进样器针头时，也常常发生液体从进样针导入口泄漏的现象。例如，进样器的针头长度太短，针头到达不了转子密封上的针头密封，显然密封不能起作用，自然就会发生泄漏；针头的直径相对于针头密封的孔径来讲太小时，转子密封上的针头密封也不能起到密封的作用，同样会发生泄漏。标准的针头尺寸为长5.08cm(2 inches)，外径0.71 cm(0.028 inches)，平头。
切记:不能使用弯曲、带尖或锥形的进样针。
3．统压力异乎寻常的高，产生这种现象的原因有几种:
a．色谱系统压力只是在进样阀的旋柄位置转换时升高，然后又返回至正常值。出现这种现象的原因通常是进样过程中，旋柄旋转速度相对较慢，当进样阀正好处于取样和进样位置之间时，流体处于完全断路状态，因此造成压力瞬间增加；而当进样阀完全处于进样或取样状态时，全部流路连通，压力又降至原值。某些型号的进样阀在旋柄转动时还会产生流体扰动，也会使压力瞬间升高。解决问题的方法很简单：快速转动进样阀的旋柄即可。这也是人们常说“进样过程动作要快但是又要轻”的原因。Rheodyne公司的部分进样阀，如3725型和7725型进样阀，采用了液体连续流动的专利设计，即当转动旋柄时，定子表面的通道在断开前将另一通道连通(make-before-break design，MBB，即不断流设计)，这样就不会有瞬间的流体扰动和压力的突变。Waters公司的U6K进样阀也有类似的功能。而Rheodyne公司其他型号的阀，如7125型进样阀，当阀从一个位置切换至另一位置的瞬间，进样阀的1＃孔未与3＃孔连接，色谱流路完全中断，使流体产生扰动。因为流路的阻断，必然导致泵输出压力的迅速升高，甚至达到超压导致泵停止工作的现象。当进样阀的旋柄转动较慢，而流动相的流速又很高时，这种效应就更加明显。通常情况下，这种瞬间的压力变化对色谱系统不会产生影响，但是当使用对流体脉动敏感的检测器、或耐压较低的色谱柱、或易受流体或压力变化干扰的泵时，应该选用连续流动设计的进样阀。
b．进样阀不论在取样还是进样位置，压力一直保持很高，且明显高于不连接进样阀而只连接色谱柱的压力。这种情况下，判断故障的位置相对要麻烦一些。将进样阀的旋柄置于进样位置，观察下列条件下压力的变化情况，以判断故障发生的位置。
Ⅰ在进样阀的3＃孔处断开与色谱柱的连接，如果压力返回正常值(应该近似为O，与流动相的流速、连接管路的长度及内径和样品定量管的类型有关)，那么压力升高的原因是色谱柱或与色谱柱连接管路堵塞，进样阀本身并没有问题。更换或清洗色谱柱或色谱柱的连接管路就可以解决问题。
Ⅱ在进样阀的3＃孔处断开与泵的连接，如果压力仍然很高，则是与泵连接的管路堵塞或出现了故障，而进样阀本身没有问题。解决方法：排除泵的故障，清理连接管路。
Ⅲ重新与泵连接，卸下样品定量管并启动泵，如果此时压力仍然很高，可能的原因是固体颗粒杂质堵塞了进样阀的1＃孔，2＃孔或转子密封面上的流路沟槽。解决的方法是清洗上述部件。
Ⅳ仅在进样阀的1＃孔连接样品定量管，如果压力仍旧很高，原因是固体杂质堵塞了样品定量管。解决方法是清洗或更换样品定量管。
Ⅴ其他原因可能是固体颗粒杂质堵塞了进样阀的3＃孔，4＃孔或转子密封面上的沟槽。解决方法是清洗上述相应部位或部件。
在排除堵塞固体颗粒杂质的过程中，必须在完成每一步后，都要进行流体测试，以检查流路是否恢复正常。请读者注意下述的每一个步骤：
1)              断开色谱柱的连接，将泵连接到进样阀的3＃孔，在尽可能高的流速下，在进样阀的取样和进样两个位置反向冲洗；
2)              清洗进样阀的定子、样品定量管或样品溢出管时，须将上述部件浸在一定量的合适溶剂中，在超声波清洗器中超声清洗至少5min；
3)              可以使用外径为0.25mm(O.0010in)或更细的不锈钢丝直接疏通定子面密封总成上的小孔；
4)              在清洗转子密封上的通道时，必须非常小心，不能划伤其抛光过的表面；
5)              如果清洗困难，而且经济条件也允许，直接更换已经磨损或损坏的部件是最简单的方法。
4．进样阀堵塞
通常进样阀的管路堵塞后会产生两种现象：
1)  取样困难，系统压力可能正常也可能较高；
2)  取样并不困难，但系统压力很高。当使用缓冲溶液作流动相时常会出现上述现象。
有许多物质能够堵塞进样阀的管路，如缓冲溶液的盐结晶，样品或流动相中的悬浮物，管路或连接件的毛刺以及泵密封圈磨损产生的颗粒等。有效防止进样阀管路堵塞的方法有：
1)  对流动相和样品进行过滤处理，以除去其中的固体杂质；
2)  在泵和进样阀之间安装过滤器(也称在线过滤器)，以滤除因泵的密封圈磨损而产生的颗粒；
3)  如果流动相或样品溶剂中使用缓冲液，定期用清水冲洗进样阀，同时，在关机前必须用清水冲洗进样阀；
4)  使用**刺的管路和连接件，以防金属粉末进入系统。

在上述方法中，方法l是最简单、最积极有效的，而且是独立于分析系统之外的操作，但这一有效的方法经常被用户忽视。


事实多次证明，只要简单地过滤流动相和样品，就可以防止非常多的麻烦，有时甚至可以防止一些莫名其妙产生的麻烦。所用滤膜(过滤膜)的孔径至少要0.45μm，根据需要滤膜的孔径也可以为0.22μm。另外，要根据流动相或样品的性质选用合适的滤膜材质；过滤系统必须非常干净，否则在过滤过程中又将引入新的固体杂质。
进样阀管路完全或部分堵塞时解决的方法：
取样时样品很难进入样品定量管或阻力很大解决这个问题的关键是要确定进样阀管路中堵塞的具体位置。下面介绍确定堵塞的具体位置及其相应的解决方法。
a．卸下进样阀6＃孔上的样品溢出管。如果此时阻力消失，则说明是固体杂质堵塞了样品溢出管。解决的办法是卸下并清洗样品溢出管，且在以后的使用过程中要定期冲洗样品溢出管，尤其是当流动相或样品中含有缓冲溶液时，定期冲洗就更为必要。
b．卸下进样阀上的样品定量管。如果此时阻力仍然存在，则说明是固体杂质堵塞了注射进样针密封或与4＃孔相连的定子通道。解决方法：卸下样品定量管，在进样阀的取样位置，用进样针导人口清洗器(进样阀所配的标准附件，P／N7125-054)冲洗注射进样针导入口2～3次。
c．在进样阀的4＃孔上重新连接上样品定量管。如果阻力恢复至原来的水平，则说明是固体杂质堵塞了样品定量管。解决方法非常简单，即：清洗或更换样品定量管。
d，在进样阀的1＃和4＃孔位置上重新连接上样品定量管。如果阻力复原，则说明是固体杂质堵塞了定子、定子面密封总成和与转子密封相连的1＃孔通道。解决方法：清洗所有的这些通道，即：卸下进样阀上的样品定量管，将进样阀处于进样位置，以高流速的流动相冲洗这些通道，并且在今后的使用中，必须定期冲洗这些通道，如果流动相或样品溶液中含有缓冲液时，定期冲洗尤为必要。


其他说明：


如果清洗管路不能解决问题，可以考虑清洗进样阀上的6＃孔。清洗注射进样针导入口的常规步骤为：设置泵流量为1 mL／min，用注射针导入口清洗器进行冲洗。冲洗必须在进样阀处于进样位置时进行，这样才可以保证流体由进样阀上的5＃孔直接流出，而不经过样品定量管。如果没有进样针导入口清洗器，可以直接使用大号的注射器进行清洗。


为彻底清洗进样阀，在取样位置要另外冲洗4＃和6＃孔的通道，以及6＃孔上的样品溢出管。如果为了冲洗除去结晶的盐，一定要用水冲洗而不能直接用有机溶剂冲洗。


在常规操作中，当进样阀转到进样位置后即可移去进样注射器。如果继续保持在这一位置，而不是退回取样位置，则流动相连续通过样品定量管，实际上起到了清洗作用。建议色谱操作者每进样1O～20次清洗一次注射进样针导入口，以使注射进样针导入口充满液体．并注意在下一次分析之前冲洗。


清洗样品定量管或定于通道的方法为：拆下这些单个部件，将其浸在一定量的合适溶剂中，在超声波清洗器中超声至少5min。也可以采用0.25m(0.010in)或更小外径的不锈钢丝除去不能溶解的固体杂质。
泵在较高流速下反向冲洗注射进样针导入口这一方法，在清洗特定的流路时也是

七、色谱柱

按应用范围分类
正相柱、反相柱、离子交换柱、糖柱、有机酸柱、手性柱、制备柱、GPC凝胶柱等等。
按填料分类
C18、C8、C3、SiO2、凝胶、氨基柱、氰基柱等
液相色谱柱系统选择的必要条件
1、有满意的分离度
2、有合适的保留值范围
3、最佳操作条件下分析时间最短
七、液相色谱柱的安装：
1、液相色谱柱的结构：
a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。

柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺 纹，另一端是3／16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7／16英寸外螺纹与1／4英寸柱管(Φ6.35mm)连接，中间放置压坏用于密封。3／16英寸的内螺纹与1／16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2．5mm长或其他固定尺寸)。
在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。
b、柱填料：

液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。

正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3—10µm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。
反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。

常用的其他的反相填料还有键合C3、C4、C8、苯基等，其颗粒粒径在3—10µm之间。
2，色谱柱的安装：
a、拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。
b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。
c、 按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧1／4-1／2圈，切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧1／4圈，直至不漏液为止。

八、液相色谱柱的使用：

色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。
1、样品的前处理：
a、最好使用流动相溶解样品。
b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产
c、使用0.45µm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制：

液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因
此要求流动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时
间保留在柱中)。
b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；
同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可提高温度降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用
对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既
有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、流动相流速的选择：

因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：
a．由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。
b．对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没
有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子
水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。
c．含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过
夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。
d．流动相要求使用0.45µm滤膜过滤，除去微粒杂质。
e．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，
提高柱性能。
4、柱性能测试：

启动液相色谱仪：a、流动相流速设定为1ml／min。
b、UV检测器波长设定为254nm。
使用出厂测试时使用的流动相组成及测试样品。记录并计算测试结果。