主题：【分享】液相色谱进样量的影响

原则：

对于柱长为50~250 mm，内径为4~5 mm进行的分离，样品中单个化合物的量应该≤50 μg，样品的进样体积也应≤25 μl（当把流动相用作进样的溶剂）。

对于内径比较小的柱子，样品大小应该减少至与柱子直径的平方成正比。如果样品中包含可电离的分子，样品量＞1 μg就会出现柱子超载的现象。

样品进样量对HPLC分离效果影响基于以下原因：

· 为了避免由于样品进样量太大，而在分离中出现不想要的变化；

· 为了增加痕量分析中检测器的敏感度需要使用尽可能大的样品进样量；

· 为了在制备 HPLC 中最大化回收净化后的产品量。

由于样品的进样体积或进样量太大而造成的分离度和（或）保留时间的变化，分别称为体积超载和质量超载。

体积超载：样品体积对分离效果的影响

假设样品中的分子浓度保持不变，样品体积对峰的尺寸和形状的影响如下图所示，随着样品的进样体积按照进样顺序1~4不断增加，色谱峰开始逐渐加宽，然后形成一个平扁的顶部。
                                                                                      几种不同的色谱柱构造，它们的最大样品进样体积如下：

(150mm x 4.6mm，3μm 颗粒）Vs≤80 μl

(100mm x 4.6mm，3μm 颗粒）Vs≤50 μl

(30mm x 4.6mm，3μm 颗粒）Vs≤30 μl

(30mm x 2.1mm，1.5μm 颗粒）Vs≤4 μl

如果色谱图中较早洗脱出来的峰的分离度并不是关键，那么就可以进样较大体积的样品。

样品可能溶解在某种溶剂的溶液中而不是在流动相里。当样品溶剂比流动相要弱时，可以进样体积较大的样品而不会对峰宽和分离度造成负面影响。相反，进样溶解在比流动相强的溶剂里的样品，往往会使得色谱图中较早洗脱出来的色谱峰发生谱带加宽和（或）扭曲变形。用比流动相强的溶剂来配备样品是一种常见的错误， 如果有可能应该尽量避免。如果不方便更换样品溶剂，那么虽然样品溶解在较强的溶剂里， 但是只要进样体积够小，色谱图就不会受到影响（可以忍受）。

以1:1的比例用较弱的A溶剂（比如水）稀释样品，然后以2 倍的体积进样。这样做能有效地减少样品溶剂带来的问题（尤其是当一个样品溶剂＞50%B) ，而同时也能保持进样的样品量不变。较大的进样体积和较强的样品溶剂可以在梯度洗脱法里使用，因为在梯度洗脱开始的时候样品会和较弱的流动相（较低的％B ）混合。如果有疑问，那么将进样体积减小为原来的一半以及增加为原来的2 倍，并且观察不同的进样体积对分离度的影响，接着再根据相应的情况作进一步调整。

质量超载：样品重量对分离效果的影响

即便样品的进样体积较小，溶解样品的质量也会有可能导致色谱柱超载，造成样品峰的加宽和变形。这种情况的发生是因为柱子保留样品分子的容量是有限的；也就是说靠近峰带的固定相中样品饱和。下图显示的是一个由于柱子超载而造成的谱带加宽的例子。样品进样量的大小顺序为1a<1b<1c<1d<2<3<4（最大进样量）。                                                                                                                  只要样品中各个成分的重量不要过多（ 通常对于4.6 mm 内径的柱子进样量<50 μg ，内径小的柱子，进样量也相应要减少），每个峰带在柱子内的移动就不会受到样品中其他峰带的影响。因此，样品中单个化合物的重量，往往决定了色谱柱是否会超载，峰形是否会发生改变，而与样品总重量无关。其中一个化合物引起色谱柱的超载，也不会影响到样品中其他色谱峰的分离（只要它们都是基线分离的）。只有当单个化合物的进样量太大，才会发生色谱柱超载的现象并同时出现色谱峰的拖尾（ 比如对于内径为4.6 mm 的柱子进样量＞50 μg)。                                                                                                                                                                                                                                                                                                                              避免进样过多所引起的问题

以常规的HPLC 分离实验执行样品分析的时候，针对同样的分离程序，最好能保证不同化合物的k、N和Rs值保持不变。这个要求简化了基于保留时间的定量分析和色谱峰的识别。要保持k、N和Rs的值不变，就必须保证样品的进样量足够小，以避免柱子超载，并且分离效果也就不会随着样品进样量大小而变化，通常需要样品量和体积都不超过一定的界限。样品体积一般在HPLC 实验里是保持不变的，主要担忧的是样品中的分析物浓度过高。再次，Wmax的值应该是指样品中各个化合物的重量， 而不是样品的总重量。举例说，如果样品中没有一个成分超过样品总量的10% ，那么与仅仅含有单个成分的样品相比，此样品的最大样品进样量就可以多10 倍。

比预想的样品浓度要高

如果一个分析物在不同样品中的浓度不同，那么质量超载就可能会由于样品浓度过高而发生，造成分离度丢失，保留时间改变。分析物的浓度或重量对分离结果造成的这种影响，应该在最后的HPLC 程序中都要考虑到（在方法建立之后）；样品的最大进样浓度或者最大进样重量Wmax应该早早确定，这样就能避免因为样品超载引起的问题，包括检测器的超载，引起非线性的检查结果。超过这个浓度的样品就要再次稀释或者重新分析。

痕量分析

在痕量分析中，最好能把峰高最大化，从而增加信噪比。通常被进样的痕量分析物的量都非常小，因此不会造成色谱柱超载的问题，但是样品中的其他成分却可能会引起色谱柱超载，可能会对分析物的分离效果造成潜在的负面影响。也就是说一个化合物的进样量如果过大，则可能会影响邻近的另一个色谱峰谱带的分离效果。

如果样品中包含过多干扰性的化合物，在展开HPLC分离实验前最好就是能把样品清洁一遍，除去干扰的化合物。在痕量分析中，进样最大可能的样品体积是有利的。当感兴趣的色谱峰和邻近的峰分离非常好并且也有足够的样品可以使用的话，增加样品的进样体积有助于一步增加峰高。如果溶解样品的溶剂远比流动相弱，那么我们就可以使用较大的进样体积，并且色谱峰的大小也能保持与进样体积成正比，而不会出现额外的谱带加宽的问题（这个方法尤其在梯度洗脱的时候会常用到）。这种增加检测器灵敏度的方法是以充足的样品量为前提的。