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液相色谱（LC）

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主题：【第六届原创】柳暗花明之色谱柱另类用法

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东风恶

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发表于：2011/08/01 01:18:15 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

维权声明：本文为YJYQXCYS原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。

没有做不到的事情，只是没有找到解决问题的方法。
下面简单谈谈我在液相分析中遇到的问题以及解决方法：
1.一只普通的色谱柱代替价格昂贵的色谱柱：
（1）原方法为：

色谱条件与系统适用性试验用CROWNPAK CR(+)为填充剂，以水（加高氯酸调节pH至2.0）为流动相；检测波长为200nm；流速为每分钟0.4ml；柱温为25℃；取****品，加流动相制成每1ml中含10μg的溶液，取20μl注入液相色谱仪，各组分出峰顺序依次为右旋异构体和左旋异构体，对映体间的分离度应大于1.5，理论板数按****左旋异构体峰计算，应不低于1000。

测定法取本品的细粉适量（约相当于****10mg），精密称定，置100ml量瓶中，加流动相适量，充分振摇，使****溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称定****对照品约10mg，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液。分别取供试品溶液和对照品溶液20μl注入液相色谱仪，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。

（2）由于大家都知道专用的手性色谱柱不耐用，呵呵呵。。。愁了好几天，死马当活马医。。。最后按照中国药典2010年版的方法试验。方法如下：

试验条件：

色谱柱（柱长：250mm，内径：4.6mm，填料：C₁₈，填料粒径：5μm，由上海月旭提供）
UV检测器（检测波长：270nm）

柱温：35℃

流动相：硫酸铜D-苯丙氨酸溶液（取D-苯丙氨酸1.32g与硫酸铜1.0g，加水1000ml溶解）-甲醇（100:10）

流速：0.8ml/min

运行时间：20min

系统适用性：取****消旋对照品，加水制成每1ml中含0.1mg的溶液，取20μl注入液相色谱仪，各组分出峰顺序依次为左旋异构体和右旋异构体，对映体间的分离度应大于1.5，理论板数按****左旋异构体峰计算，应不低于3000。

具体试验操作：取本品的细粉适量（约相当于****125mg），精密称定，置25ml量瓶中，加水适量，充分振摇，使****溶解，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另取****对照品约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液。分别取供试品溶液和对照品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。色谱图：

2.抗生素聚合物，特别是辅料干扰，有些辅料是大分子物质，影响聚合物的准确检出，采用固相萃取方法，但是很难证明固相萃取的方式是否干扰高分子缔合，因为我没有聚合物对照品；我突发奇想，就按照药典的方法，在不改变聚合物的分离机制的情况下，在凝胶色谱柱后串连一只月旭的普通的C18色谱柱。既然成功的分离出来了。
两只凝胶色谱柱（大连依利特）色谱图：

串连C18色谱柱色谱图：

但是方法要验证啊！按照中国药典2010年版二部的方法，要进行聚合物出峰保留时间的定位。我用原料药和葡聚糖2000定位，前面的峰为葡聚糖2000。
色谱图：

以上的方法与国家标准方法不一致，一定要做方法的验证，验证内容：
1.变更方法的理由，两种的方法的原理对比；
2.方法学验证的内容要全面，我在方法变更的基础上，增加了色谱图的两种方法的光谱行为差异的对比；
3.方法变更，有时给专家印象为较怪，但一定得有道理。

该帖子作者被版主 boboenid007加 3积分， 2经验，加分理由：鼓励原创

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2011/8/1 2:01:11 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

鉴于保密，以上研究的品种。。。
有兴趣的朋友，留心一下就知道我在做什么了，呵呵。。。
大家晚安！

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风中午荷

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学习ing...

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2011/8/1 10:07:48 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

哎呀!都凌晨两点了,东风恶版主辛苦了!这篇文章太妙啦!

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雪妖

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2011/8/1 10:51:39 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

首先恭喜东风恶同志的大作在建军节的第一时间出台了，恭喜恭喜，有几个问题想要请教一下

1、第一个手性异构体的样品，您柱子平衡的时候用了多少时间？这个方法是10版药典中的原方法吗？
2、您是要做方法的申报吗？方法验证的时候需要具体做些什么工作？通过药检所审核的几率有多大？因为各个地方药检所的人员对标准方法修改后的接受和理解都有很大的差异？
3、凝胶柱后面再加C18，保留时间相差不大，是因为开始的时候是两根凝胶柱，后来用一根凝胶柱 + 一根C18是吧，但是凝胶柱和C18柱的分离机制是不一样的，这样检测聚合物也行吗？
您的样品图中保留时间是9.4min和12.7min这两个是上面标准品中的两个峰吗？那9.4min左右这个是葡聚糖2000了。

这篇文章对我真的有很大的启示，有很多东西也要更深入的学习，先就这几个问题请教一下，谢谢。

该帖子作者被版主 boboenid007加 2积分， 2经验，加分理由：鼓励交流

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2011/8/1 10:54:09 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 samanthalas(samanthalas) 发表:
哎呀!都凌晨两点了,东风恶版主辛苦了!这篇文章太妙啦!

看完3D变形金刚睡不着。。。

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东风恶

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2011/8/1 11:07:24 6楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

感谢您的关注，谢谢！

原文由 雪妖(czj_1027) 发表:
首先恭喜东风恶同志的大作在建军节的第一时间出台了，恭喜恭喜，有几个问题想要请教一下

1、第一个手性异构体的样品，您柱子平衡的时候用了多少时间？这个方法是10版药典中的原方法吗？
答：时间约1小时。中国药典2010年版二部方法见：
2、您是要做方法的申报吗？方法验证的时候需要具体做些什么工作？通过药检所审核的几率有多大？因为各个地方药检所的人员对标准方法修改后的接受和理解都有很大的差异？
答：我们主要是做的6类仿制药，方法验证内容按照指导原则来。通过的几率只有天知道。是的，也征求过省所的意见，他们的意见是把方法学验证做完，再评价。
3、凝胶柱后面再加C18，保留时间相差不大，是因为开始的时候是两根凝胶柱，后来用一根凝胶柱 + 一根C18是吧，但是凝胶柱和C18柱的分离机制是不一样的，这样检测聚合物也行吗？
您的样品图中保留时间是9.4min和12.7min这两个是上面标准品中的两个峰吗？那9.4min左右这个是葡聚糖2000了。
答：是的，我在流动相中加入了乙腈，不然出峰时间太久了。

这篇文章对我真的有很大的启示，有很多东西也要更深入的学习，先就这几个问题请教一下，谢谢。