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主题：【原创】【极限体验】Ultimate XB-C18柱监测京尼平苷水解全过程（10月份）

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发表于：2011/10/22 10:15:14 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
该帖子已被samanthalas设置为精华；
【名词解释】
此处采用最通俗的说法，书上那些复杂的定义，这里不讲究；
苷：在母核上，连接一个或多个糖，一般就叫苷，极性较大；
苷元：单纯地母核，或者母核去掉一个或多个或所有的糖，就称其为相应苷的苷元，极性较小；
比如A结构＝B结构+糖，那么B就是A的苷元形式，A就是B的苷；

【发贴背景】
1. 分到了化合物就需要对其进行活性测试（没有活性发不了SCI）；
2. 一般来说，苷元的活性比苷的活性要好，而我分到的都是些苷；
3. 综合第1点和第2点，我要将苷进行水解，得到苷元成分；

【如何水解】
1. 水解分很多种，酸水解，碱水解，酶水解，等等；
2. 酸水解我嫌麻烦，碱水解我不乐意，酶水解我才喜欢；

【为何选择酶水解】
1. 我有相应的水解酶（β-D-葡萄糖水解酶）；
2. 它干净，不需要用到其它试剂；
3. 它专一，基本没有其它副产物；
4. 它速度，几个小时就可以完成了；
5. 最重要的：我很喜欢，我说了算；

【水解反应】
样品处理：1g样品用少量甲醇溶解后加入200ml水稀释，后加入250mg酶；
反应条件：放入40度水浴锅恒温加热，搅拌，全程监测；
下图，左为京尼平苷，右为苷元：京尼平；

【仪器试剂】
水：重蒸水
甲醇：色谱纯，天津大茂       
HPLC：Waters 高效液相
Waters 996 DAD检测器
Waters Model 600 controller[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相色谱[/url]

【色谱条件】 
色谱柱：Ultimate XB-C18柱（5μm, 4.6x250mm）
流动相：40%甲醇/水（V：V）
流速：1.0ml/min
柱温：常温（约25度）；
检测波长：全波长检测；
进样量：5微升；

【实验过程】
这是京尼平苷反应前的色谱图


反应开始后，大约是半小时（没有确切时间）后取样过滤后进针
通过进行峰面积比较，京尼平苷：京尼平＝77：23


反应又进行了一段时间（没记时）
通过进行峰面积比较，京尼平苷：京尼平＝62：38


反应又进行了一段时间（真没记时）
通过进行峰面积比较，京尼平苷：京尼平＝55：45


反应又进行了一段时间（我真的没记时）
通过进行峰面积比较，京尼平苷：京尼平＝17：83


反应又进行了一段时间（我真的没记时，反正到午饭的时间点了）
已经全部转化完毕了，干燥后等着交样品测活性吧


【结果与讨论】
1. 酶水解，简单、快速、方便、低廉、干净；前提：你有相应的酶（葡萄糖苷酶还是很容易得到的）；
2. 由于糖没有紫外吸收，所以所有的谱图均未看到糖信号，利用示差应该是可以检测到的（不过40%的流动相，出峰会很早）；示差我们是有的，但是平衡太麻烦我不乐意开，最重要的是，糖能否检测到跟本实验关系不大；
3. 比值为77：23那张图，好像显示一些其它双紫外吸收的小杂质，后来几张图没有了，应该也被水解了；
4. 取的样品没有考虑量的多少，吸收基本都在1.0以上（很大），倾向的重点是转化的过程；
5. Ultimate XB-C18，很多人问我极限的柱子到底怎么样，看图说话嘛，上面好多图啊，呵呵；
6. 另外，这款柱子，其实跟某日本知名品牌柱子（为避免不必要的麻烦，不透露品牌）分离效果差不多，但是呢，柱压要低30%左右，这是最普通最形象的比较结果。
7. 价格比较？那得问小S小卢了，反正我是试用。。
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dahua1981
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2011/10/22 11:44:31 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
期待kaikaifeng的大作
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arvid2007
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2011/10/22 13:03:23 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
kaikaifeng这个月高产量啊，看来又要煮螃蟹了
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kaikaifeng
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2011/10/22 13:19:50 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 arvid2007(arvid2007) 发表:
kaikaifeng这个月高产量啊，看来又要煮螃蟹了

螃蟹有点腻味了，吃了好几次了
不过今天可能再煮一次
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2011/10/22 13:20:22 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 dahua1981(dahua1981) 发表:
期待kaikaifeng的大作

在整理，今天上午开始做的反应
用的是酶水解，很干净的样品
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arvid2007
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2011/10/22 14:10:12 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
【为何选择酶水解】
1. 我有相应的水解酶（β-D-葡萄糖水解酶）；
2. 它干净，不需要用到其它试剂；
3. 它专一，基本没有其它副产物；
4. 它速度，几个小时就可以完成了；
5. 最重要的：我很喜欢，我说了算；
这个选择的理由很特别啊
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kaikaifeng
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2011/10/22 14:13:49 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
其实啊，这个用薄层检测就可以了
这两个东西，在薄层上用浓硫酸-香草醛显色很清楚
但是，极限体验也是不能没有的
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冷冷的冰雨
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2011/10/22 16:25:37 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
kaikaifeng的文章写的很好，赞一个！为什么不参加原创啊？肯定是一等奖啊，别的不说，方法有创新性、前瞻新！每一步都有图谱作为说明，很有说服力！这正是原创所缺少的精髓！
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冷冷的冰雨
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2011/10/22 16:29:56 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
看了kaikaifeng的文章有几个问题问一下：
1、你分离的甙和甙元完全是此消彼长的，在转化的过程中没有生成新的杂质吗？是甙少10%，甙元就增加了10%吗？
2、在中草药分离的过程中，很难分到80%以上才纯品，在这些图谱中很难看到杂质峰，请问你用的是对照品吗？
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冷冷的冰雨
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2011/10/22 16:34:47 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 头像更新中，请稍候…(kaikaifeng) 发表:
其实啊，这个用薄层检测就可以了
这两个东西，在薄层上用浓硫酸-香草醛显色很清楚
但是，极限体验也是不能没有的

薄层不能定量啊，或者说薄层定量相对液相较差
有些东西从薄层上升的液相，在技术领域是有质的飞跃的
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冷冷的冰雨
xy4585618
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2011/10/22 16:35:50 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 arvid2007(arvid2007) 发表:
【为何选择酶水解】
1. 我有相应的水解酶（β-D-葡萄糖水解酶）；
2. 它干净，不需要用到其它试剂；
3. 它专一，基本没有其它副产物；
4. 它速度，几个小时就可以完成了；
5. 最重要的：我很喜欢，我说了算；
这个选择的理由很特别啊


还有一个重要的原因就是酶解的过程比较缓和 
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